Sinh phẩm sử dụng trong nghiên cứu

Một phần của tài liệu Luận án nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng vi rút beijing 1 để ứng dụng sản xuất vắc xin viêm não nhật bản bất hoạt trên tế bào vero tại việt nam (Trang 48)

STT Sinh phẩm Hãng/nguồn gốc

1 Chủng gốc Beijing-1

Beijing-1, nguồn gốc từ Viện Kanonji thuộc Trường đại học Osaka, Nhật Bản

2 Chủng Nakayama Vabiotech

3 Ngân hàng tế bào Vero Vabiotech (mua từ ATCC)

4 Ngân hàng tế bào BHK21 Vabiotech(mua từ ATCC)

5 Ngân hàng tế bào MRC5 Vabiotech(mua từ ATCC)

6 Kháng huyết thanh VNNBsản xuất từ chuột Swiss Vabiotech

7 Sinh phẩm ELISA-Ag Vabiotech

8 Bộ sinh phẩm QIAamp®Viral RNA mini Qiagen

9 Bộ sinh phẩm Super ScripTM one-step with Platium taq Invitrogen 10 Bộ sinh phẩm BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing ABI

Bảng 2.3. Mơi trường, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

STT Mơi trường, hóa chất Hãng

1 Canh thang Thioglycolate (FTM: Thioglycolate Fluid Medium) Sigma

2 Môi trường MEM(Minimum Essential Medium) Gibco

3 Dung dịch nhuộm cố địnhCrystal violet 5% VABIOTECH

4 Huyết thanh bào thai bê(FBS) Gibco-Thermo

5 Dung dịch Trypsin – EDTA Gibco-Thermo

6 Dung dịch Hank's VABIOTECH

7 Dung dịch Alserver VABIOTECH

8 Dung dịch PBS, pH 7 VABIOTECH

9 Thạch PPLO(pleuropneumonia-like organisms) HiMedia

10 Canh thang PPLO HiMedia

11 NaCl Merck

12 Na2HPO4.12H2O Merck

13 KH2PO4 Merck

14 KCl Merck

15 Tween 20 Merck

Bảng 2. 4. Trang thiết bị, vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu

STT Thiết bị Hãng

1 Máy đo nhiệt độ thỏ có độ chính xác 0,1oC Ellab

2 Tủ nuôi cấy tế bào JISICO

3 Tủ ấm(30-35oC) MEMMERT

4 Tủ mát(20-25oC) SANYO

5 Pipet tự động, bán tự động DRUMMOND

6 Máy lắc IKA

7 Kính hiển vi soi ngược OLYMPUS

8 Hốt vô trùng TELSTAR

9 Cân động vật(0-420g cho chuột nhắt; 0-2100g cho chuột lang) SATORIUS

10 Máy ly tâm lạnh BECKMAN

11 Nồi hấp vô trùng HIRAYAMA

12 Máy ly tâm Eppendorf EPPENDORF

13 Máy rửa bản ELISA SANOFI

14 Máy đọc kết quả ELISA SANOFI

15 Máy ủ 4 tấm Sanofi IPS SANOFI

16 Máy khuấy từ MIDI MR1 IKA

17 Máy đo pH Thermo FNH

18 Hệ thống máy Real-time PCR CFX96TM BioRad

19 Máy giải trình tự gen NGS ThermoFisher

20 Máy ủ nhiệt khô MS0030 BioRad

21 Cân phân tích (0,082-220g) XSR204 Mettler toledo

22 Cân phân tích (sai số 4 chữ số) Satorius, Đức

2.2.2. Động vật thí nghiệm

Bảng 2. 5. Trang thiết bị, vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu

Giống Trọng lượng Số lượng Giới tính

Chuột nhắt ổ 1-3 ngày tuổi Swiss/ICR / 80 con Đực và cái

Chuột nhắt trắng 3 tuần tuổi Swiss/ICR 11-13 g 600 con Đực và cái

Chuột nhắt trắng 4 tuần tuổi Swiss/ICR 17-22 g 350 con Đực và cái

Chuột lang Việt Nam 250 – 450 g 40 con Đực và cái

Thỏ Newzealand 1,8 – 2,5 kg 60 con Đực và cái

2.3. Thiết kế nghiên cứu

Sơ đồ hình 2.2. Mơ tả tóm tắt các thử nghiệm kiểm tra chất lượng chủng MSV, WSV và vắc xin JECEVAX. Nội dung được thực hiện trên 2 nhóm đối tượng nghiên cứu: Chủng vi rút VNNB được sản xuất gồm lô chủng gốc BV-MSV-0210 và lô chủng sản xuất BV-MSV-0310; 10 lô vắc xin Viêm não Nhật Bản JECEVAX.

Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu BV-WSV-0310 BV-WSV-0310

Mycoplasma

Hiệu giá và ổn định về hiệu giá Ổn định di truyền

Sản xuất từ 2010 đến 2018

2.4. Biến số và nội dung nghiên cứu

Bảng 2. 6. Chỉ tiêu nghiên cứu trên lô chủng gốc BV-MSV-0210 và lô chủng sản

xuất BV-WSV-0310

TT Chỉ tiêu Phương pháp Tiêu chuẩn viện dẫn

1

Nhận dạng chủng MSV và WSV với kháng thể đặc hiệu

ELISA TCCS; DĐ Châu Âu, 2018; WHO

TRS 963, PL1 2 Nhận dạng và xác định tính ổn định di truyền của chủng MSV và WSV

Giải trình tự gen TCCS, DĐ TQ, WHO TRS 963

3 Tương đồng nucleotide Giải trình tự gen TCCS, DĐ TQ, WHO TRS 963

4 Tương đồng protein Giải trình tự gen TCCS, DĐ TQ, WHO TRS 963

5 Hiệu giá vi rút trên tế

bào Tạo đám hoại tử PFU TCCS, DĐVN V, 2017; Dược điển

Châu Âu, 2018; WHO TRS 963

6 Hiệu giá vi rút trên

động vật thí nghiệm Thử trên não chuột nhắt TCCS, DĐVN V, 2017; Dược điển Châu Âu, 2018; WHO TRS 963 7 Nhiệt độ bảo quản phù

hợp

Hiệu giá chủng được kiểm tra sau khi bảo quản ở các dải nhiệt độ khác nhau, trong các khoảng thời gian khác nhau

TCCS, WHO TRS 963

8 Vô trùng Cấy trực tiếp trên môi trường

Thioglycholate và soybean casein

DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1

9 Kiểm tra nhiễm

Mycoplasma

Cấy trên môi trường PPLO lỏng I, II,

thạch PPLO DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1 10 Vi rút ngoại lai trên chuột

nhắt Thử trên chuột nhắt (tiêm não và phúc mạc) DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1 11 Vi rút ngoại lai trên chuột

nhắt ổ Thử trên chuột nhắt ổ (tiêm não và phúc mạc) DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1 12 Vi rút ngoại lai trên

chuột lang Thử trên chuột lang (tiêm phúc mạc) DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1 13 Vi rút ngoại lai trên tế

bào Tế bào Vero, BHK21, MRC5 DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018;

Bảng 2.7. Chỉ tiêu nghiên cứu trên vắc xin JECEVAX

TT Chỉ tiêu Phương pháp Tiêu chuẩn chấp nhận Tiêu chuẩn viện dẫn

1 Cảm quan Quan sát bằng mắt thường Dung dịch trong suốt, đồng nhất và khơng có vật thể lạ

DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1

2 Thể tích Cân và đo tỷ trọng ≥ 1,0 ml DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1 3 pH Máy đo pH 6,8-7,4 DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1 4 Hàm lượng Thimerosal Thuốc thử acetylacetone, đo OD, = 415nm (DĐVN IV, 2009, PL15.29)

≤ 120 µg/ml DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1 5 Hàm lượng Formaldehyde Thuốc thử Ditizon, đo OD, = 480 nm (DĐVN IV, 2009, PL15.25)

≤ 10 µg/ml DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1 6 Hàm lượng DNA tồn dư PCR/ phương pháp lai điểm ≤ 10 ng/ml DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1 7 Hàm lượng

protein tổng số Lowry ≤ 80 µg/ml DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1

8 Kiểm tra vô

trùng

Cấy trực tiếp trên môi trường

Thioglycholate và

soybean casein

(DĐVN IV, 2009, PL15.7)

Khơng có sự phát triển của vi khuẩn và nấm sau 14 ngày theo dõi

DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1

9 An toàn chung DĐVN IV, 2009,

PL15.11

Trong vòng 7 ngày theo dõi toàn bộ động vật thí nghiệm sống, khỏe mạnh, tăng cân và khơng có biểu hiện bệnh lý hoặc nhiễm độc

DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1

10 Chất gây sốt Tiêm tĩnh mạch tai thỏ, DĐVN V, 2009, PL 15.12

Mẫu thử đạt yêu cầu về chất gây sốt nếu nhiệt độ chênh lệch của mỗi thỏ ≤ 0,60C và tổng nhiệt độ chênh lệch của 3 thỏ ≤ 1,30C DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1

11 Cơng hiệu Phương pháp trung hịa giảm 50% đám hoại tử (PRNT50)

≥ 1,3 log PRNT50/ml; hoặc công hiệu tương quan của vắc xin thử so với vắc xin mẫu chuẩn ≥ 1,0

DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1

2.5. Phương pháp nghiên cứu (chi tiết xem phụ lục 5)

2.5.1. Kiểm định vi rút ngoại lai

Kiểm định vi rút ngoại lai là một trong các tiêu chuẩn nhằm đảm bảo chất lượng của chủng vi rút sử dụng trong sản xuất vắc xin Viêm não Nhật Bản. Phương pháp kiểm định vi rút ngoại lai bao gồm kiểm định trên động vật thí nghiệm và trên tế bào.

Tế bào được dùng để kiểm định vi rút ngoại lai gồm nhiều dòng tế bào khác nhau: tế bào Vero, tế bào MRC5, BHK-21. Chủng vi rút Viêm não Nhật bản được trung hòa với kháng huyết thanh đặc hiệu và cấy 3 ml vào 5 chai tế bào thử nghiệm. Tế bào được nuôi cấy ở 36,5  0,5oC trong vịng 14 ngày. Trong q trình ni cấy, chai tế bào được theo dõi đám hoại tử (CPE) dưới kính hiển vi soi ngược vào ngày thứ 1, 4, 7, 11 và 14.Sau 14 ngày theo dõi tình trạng phát triển của tế bào, nước nổi trong các chai tế bào được loại bỏ để kiểm tra vi rút hấp phụ hồng cầu. Chủng vi rút Viêm não Nhật Bản đạt yêu cầu kiểm định vi rút ngoại lai khi thử nghiệm không phát hiện tế bào bị hủy hoại (CPE) và khơng có vi rút hấp phụ hồng cầu.

Kiểm tra vi rút ngoại lai trên động vật thí nghiệm được thực hiện với 20 chuột nhắt trắng tiêm não, 10 chuột nhắt trắng tiêm phúc mạc, 20 chuột ổ 1-3 ngày tuổi tiêm não, 10 chuột ổ 1-3 ngày tuổi tiêm phúc mạc và 5 chuột lang tiêm phúc mạc. Chủng vi rút Viêm não Nhật Bản được trung hòa với kháng huyết thanh đặc hiệu trước khi tiêm cho động vật thử nghiệm và theo dõi tăng trưởng cân nặng, các dấu hiệu bệnh lý bất thường sau tiêm. Chủng vi rút Viêm não Nhật Bản đạt yêu cầu kiểm định vi rút ngoại lai thử nghiệm trên động vật khi:

Chuột nhắt: khơng có chuột chết, 100% chuột sống khỏe mạnh, khơng có dấu hiệu bệnh lý sau 21 ngày theo dõi.

Chuột ổ: khơng có chuột chết, 100% chuột sống khỏe mạnh, khơng có dấu hiệu bệnh lý sau 14 ngày theo dõi.

Chuột lang: khơng có chuột chết, 100% chuột sống khỏe mạnh, khơng có dấu hiệu bệnh lý, giải phẫu bệnh không thấy tổn thương phủ tạngsau 42 ngày theo dõi.

2.5.2. Kiểm định vô khuẩn

Kiểm định vô khuẩn được thực hiện nhằm đảm bảo chủng vi rút Viêm não Nhật Bản được sử dụng sản xuất vắc xin không nhiễm các tác nhân vi khuẩn hoặc nấm. Huyền dịch chủng vi rút Viêm não Nhật Bản được cấy trên môi trường Thioglycolate theo hướng dẫn của Dược điển Việt Nam 5, 2017. Môi trường Thioglycolate sau nuôi cấy được ủ ở nhiệt độ32,5±2,50C, và 22,5±2,50C trong thời gian 14 ngày. Môi trường sau nuôi cấy được theo dõi hàng ngày và ghi kết quả theo dõi vào phiếu theo dõi thử nghiệm vô khuẩn các ngày 1, 3, 5, 7, 10 và 14.

Chủng vi rút Viêm não Nhật Bản đạt yêu cầu vô khuẩn khi cả 2 loại môi trường đều trong, không bị vẩn đục, môi trường Thioglycolate khơng bị mất lớp chỉ thị màu ở phía trên.Chứng tỏ khơng có sự phát triển của vi khuẩn và nấm sau 14 ngày theo dõi.

2.5.3. Nhận dạng

Chủng gốc và chủng sản xuất vi rút Viêm não Nhật Bản sử dụng sản xuất vắc xin được kiểm định nhận dạng bằng kỹ thuật ELISA trực tiếp. Kỹ thuật dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Trong đó kháng thể IgG chuột kháng vi rút VNNB chủng Beijing-1 đã gắn vào phiến kết hợp với kháng nguyên vi rút VNNB trong mẫu thử. Sau đó cho cộng hợp IgG chuột kháng Beijing-1 gắn enzyme (peroxidase) sẽ tạo thành phức hợp kháng thể - kháng nguyên - cộng hợp. Thêm cơ chất OPD, enzyme peroxidase sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên trong mẫu thử. Đo mật độ quang học (OD) trên máy đọc ELISA ở bước sóng  = 490/620nm.

Các giá trị OD của mỗi mẫu thử và mẫu chuẩn được thể hiện bằng đồ thị logarit (xử lý số liệu trên Excel) với trục tung là độ pha lỗng, trục hồnh là các giá trị OD. Kết quả nhận dạng được xác định đảm bảo các yếu tố chứng âm và Blank không lên màu; mẫu thử và mẫu chuẩn phải có màu vàng và OD mẫu ≥ 10 lần OD Blank thì được coi là dương tính.

2.5.4. Đánh giá ổn định di truyền

Chủng gốc và chủng sản xuất vi rút Viêm não Nhật Bản sử dụng sản xuất vắc xin được đánh giá tính tương đồng về mặt di truyền bằng kỹ thuật giải trình tự gen.

Bộ gen được sử dụng trong kiểm định này là đoạn gen E bao gồm trình tự nucleotide của đoạn gen E và trình tự acid amin được tổng hợp từ gen này. Kết quả giải trình tự gen của các đợt đánh giá trên chủng gốc và chủng sản xuất vi rút Viêm não Nhật Bản được so sánh với kết quả giải trình tự gen ngay sau khi sản xuất của chính các chủng này, so sánh với chủng Beijing – Kanonji, so sánh với các chủng vi rút Viên não Nhật Bản phân lập được trên người, lợn và muỗi tại Việt Nam giai đoạn 1964 đến 2014.Quy trình giải trình tự gen E của chủng gốc và chủng sản xuất của vi rút Viêm não Nhật Bản trong nghiên cứu này được thực hiện như sơ đồ hình 2.2.

RNA tổng số được tách chiết và tinh chế từ mỗi mẫu nhờ QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen). Vùng gen E được khuếch đại bằng RT-PCR sử dụng bộ kit OneStep PCR Kit (Qiagen) với cặp mồi được thiết kế bằng chương trình Primer-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi) dựa trên trình tự gen E của vi rút Viêm não Nhật Bản. Cặp mồi có trình tự như sau::

JEV-E-p1: 5’-TTCAACTGTCTGGGAATGG-3’ (19 nu) JEV-E-p2: 5’-AGCATGCACATTGGTAGCTA-3’ (20 nu)

Với chương trình: bước 1 ở 50°C 30 phút, bước 2 ở 95°C 15 phút; lặp lại 30 chu kỳ (94°C trong 1 phút, 50°C trong 1 phút, 72°C trong 1 phút), bước 3 ở 72°C trong 10 phút và bước 4 giữ sản phẩm ở 4oC cho tới khi sử dụng. Vùng gen E được khuếch đại có độ dài tính theo lý thuyết là 1500 bp. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gen agarose 1%. Băng chứa sản phẩm PCR được thôi gel và tinh chế nhờ QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) để phục vụ cho việc giải trình tự. Giải trình tự gen được thực hiện với bộ Kit Applied Biosystems™ Sanger Sequencing Kit (Thermo Fisher) và máy giải trình tự gen ABI 3500 của Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.

Hình 2. 3. Quy trình giải trình tự gen E vi rút Viêm não Nhật Bản

Trình được gen E được phân tích nhờ các phần mềm như Blast, CLC Generation Worbench, Aliview, BioEdit, MEGA6.0...để đánh giá mức độ tương đồng và xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự vùng gen E của 2 chủng Beijing-1 với chủng chuẩn và các chủng virus VNNB phân lập từ người, lợn và muỗi ở Việt Nam từ những năm 1964 đến năm 2014 (Bảng 2.7.). Phân tích epitope kháng nguyên vùng gen E được tiến hành theo phương pháp của Luca et al., (2012).

Bảng 2. 8.Thơng tin về trình tự vùng gen E của các chủng vi rút VNNB phân lập ở Việt

Nam trong các năm khác nhau và từ các vật chủ khác nhau sử dụng trong nghiên cứu

STT Số đăng ký trong GenBank Năm phân lập Vật chủ

1 LC000631 1964 Người 2 AY376461 1986 Người 3 AY376463 1989 Người 4 HQ009263 2004 Người 5 LC000634 2007 Người 6 KP876007 2014 Người 7 JEU70420 1979 Muỗi 8 AB933311 1994 Muỗi 9 AY376468 2002 Muỗi 10 JN574431 2005 Muỗi 11 LC000635 2010 Muỗi 12 LC000637 2011 Muỗi 13 AY376464 2001 Lợn 14 AY376465 2002 Lợn 15 HQ009265 2005 Lợn 2.5.5. Hiệu giá vi rút

Chủng gốc và chủng sản xuất của vi rút Viêm não Nhật Bản được lấy ra kiểm tra sự ổn định về hiệu giá sau các khoảng thời gian (từ lúc sản xuất 2010 đến 2020) khi các lô chủng này bảo quản tại các nhiệt độ ≤ -60oC, -20oC, 2-8oC. Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng chủng theo khuyến cáo của TCYTTG cho chủng sử dụng để sản xuất vắc xin dùng cho người và WHO TRS 963, phụ lục 1 khuyến cáo về kiểm soát chất lượng chủng cho sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt dùng cho người. Hiệu giá vi rút được thử nghiệm bằng phương pháp nuôi cấy trên tế bào (PFU) và trên động vật thử nghiệm (LD50).

Chuẩn độ hiệu giá vi rút trên tế bào

Chuẩn độ hiệu giá vi rút trên tế bào được thực hiện trên tế bào BHK-21 hoặc tế bào Vero bằng kỹ thuật tạo đám hoại tử PFU trên tế bào (phiến 6 giếng). Chủng vi rút sau khi tan đơng được pha lỗng bậc 10 từ 10-1đến 10-8. Chọn 3 độ pha loãng cuối cùng để gây nhiễm lên tế bào. Chủng vi rút được gây nhiễm lên tế bào bằng cách cấy 200l

hỗn dịch virus đã pha loãng ở trên vào mỗi giếng, mỗi độ pha 2 giếng. Cho tất cả các phiến đã cấy vào tủ ấm CO2 (36,5oC ± 0,5oC; 4,5% ± 0,5% CO2) để ủ 90 phút.Cứ 30 phút láng 1 lần.Sau đó phủ thạch và nuôi cấy tiếp 4 ngày trong tủ ấm CO2 (36,5oC ± 0,5oC; 4,5% ± 0,5% CO2).Khi các plaque hiện rõ, nhuộm, cố định các đám hoại tử.

Số đám hoại tử tế bào (plaque) được đếm trong mỗi giếng. Các plaque là những đốm trắng có thể nhìn thấy bằng mắt thường ở mặt đáy, đếm các plaque. Hiệu giá vi rút được tính theo cơng thức sau:

𝐻𝑖ệ𝑢 𝑔𝑖á 𝑣𝑖 𝑟ú𝑡 (𝑃𝐹𝑈) = 𝑆ố 𝑝𝑙𝑎𝑞𝑢𝑒 𝑡𝑟𝑢𝑛𝑔 𝑏ì𝑛ℎ

Độ 𝑝ℎ𝑎 𝑙𝑜ã𝑛𝑔 × 𝑠ố 𝑚𝑙 ℎỗ𝑛 𝑑ị𝑐ℎ 𝑣𝑖 𝑟ú𝑡 đã 𝑐ấ𝑦

Chuẩn độ hiệu giá vi rút trên động vật (chuột bằng phương pháp LD50)

Hiệu giá vi rút chủng gốc và chủng sản xuất vi rút Viêm não Nhật Bản được thực hiện trên chuột nhắt trắng (giống swiss hoặc ICR) 3 tuần tuổi. Chuột được chuẩn

Một phần của tài liệu Luận án nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng vi rút beijing 1 để ứng dụng sản xuất vắc xin viêm não nhật bản bất hoạt trên tế bào vero tại việt nam (Trang 48)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(174 trang)