CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
2.5. Phương pháp nghiên cứu (chi tiết xem phụ lục 5)
2.5.4. Đánh giá ổn định di truyền
Chủng gốc và chủng sản xuất vi rút Viêm não Nhật Bản sử dụng sản xuất vắc xin được đánh giá tính tương đồng về mặt di truyền bằng kỹ thuật giải trình tự gen.
Bộ gen được sử dụng trong kiểm định này là đoạn gen E bao gồm trình tự nucleotide của đoạn gen E và trình tự acid amin được tổng hợp từ gen này. Kết quả giải trình tự gen của các đợt đánh giá trên chủng gốc và chủng sản xuất vi rút Viêm não Nhật Bản được so sánh với kết quả giải trình tự gen ngay sau khi sản xuất của chính các chủng này, so sánh với chủng Beijing – Kanonji, so sánh với các chủng vi rút Viên não Nhật Bản phân lập được trên người, lợn và muỗi tại Việt Nam giai đoạn 1964 đến 2014.Quy trình giải trình tự gen E của chủng gốc và chủng sản xuất của vi rút Viêm não Nhật Bản trong nghiên cứu này được thực hiện như sơ đồ hình 2.2.
RNA tổng số được tách chiết và tinh chế từ mỗi mẫu nhờ QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen). Vùng gen E được khuếch đại bằng RT-PCR sử dụng bộ kit OneStep PCR Kit (Qiagen) với cặp mồi được thiết kế bằng chương trình Primer-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi) dựa trên trình tự gen E của vi rút Viêm não Nhật Bản. Cặp mồi có trình tự như sau::
JEV-E-p1: 5’-TTCAACTGTCTGGGAATGG-3’ (19 nu) JEV-E-p2: 5’-AGCATGCACATTGGTAGCTA-3’ (20 nu)
Với chương trình: bước 1 ở 50°C 30 phút, bước 2 ở 95°C 15 phút; lặp lại 30 chu kỳ (94°C trong 1 phút, 50°C trong 1 phút, 72°C trong 1 phút), bước 3 ở 72°C trong 10 phút và bước 4 giữ sản phẩm ở 4oC cho tới khi sử dụng. Vùng gen E được khuếch đại có độ dài tính theo lý thuyết là 1500 bp. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gen agarose 1%. Băng chứa sản phẩm PCR được thôi gel và tinh chế nhờ QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) để phục vụ cho việc giải trình tự. Giải trình tự gen được thực hiện với bộ Kit Applied Biosystems™ Sanger Sequencing Kit (Thermo Fisher) và máy giải trình tự gen ABI 3500 của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.
Hình 2. 3. Quy trình giải trình tự gen E vi rút Viêm não Nhật Bản
Trình được gen E được phân tích nhờ các phần mềm như Blast, CLC Generation Worbench, Aliview, BioEdit, MEGA6.0...để đánh giá mức độ tương đồng và xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự vùng gen E của 2 chủng Beijing-1 với chủng chuẩn và các chủng virus VNNB phân lập từ người, lợn và muỗi ở Việt Nam từ những năm 1964 đến năm 2014 (Bảng 2.7.). Phân tích epitope kháng nguyên vùng gen E được tiến hành theo phương pháp của Luca et al., (2012).
Bảng 2. 8.Thơng tin về trình tự vùng gen E của các chủng vi rút VNNB phân lập ở Việt
Nam trong các năm khác nhau và từ các vật chủ khác nhau sử dụng trong nghiên cứu
STT Số đăng ký trong GenBank Năm phân lập Vật chủ
1 LC000631 1964 Người 2 AY376461 1986 Người 3 AY376463 1989 Người 4 HQ009263 2004 Người 5 LC000634 2007 Người 6 KP876007 2014 Người 7 JEU70420 1979 Muỗi 8 AB933311 1994 Muỗi 9 AY376468 2002 Muỗi 10 JN574431 2005 Muỗi 11 LC000635 2010 Muỗi 12 LC000637 2011 Muỗi 13 AY376464 2001 Lợn 14 AY376465 2002 Lợn 15 HQ009265 2005 Lợn 2.5.5. Hiệu giá vi rút
Chủng gốc và chủng sản xuất của vi rút Viêm não Nhật Bản được lấy ra kiểm tra sự ổn định về hiệu giá sau các khoảng thời gian (từ lúc sản xuất 2010 đến 2020) khi các lô chủng này bảo quản tại các nhiệt độ ≤ -60oC, -20oC, 2-8oC. Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng chủng theo khuyến cáo của TCYTTG cho chủng sử dụng để sản xuất vắc xin dùng cho người và WHO TRS 963, phụ lục 1 khuyến cáo về kiểm soát chất lượng chủng cho sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt dùng cho người. Hiệu giá vi rút được thử nghiệm bằng phương pháp nuôi cấy trên tế bào (PFU) và trên động vật thử nghiệm (LD50).
Chuẩn độ hiệu giá vi rút trên tế bào
Chuẩn độ hiệu giá vi rút trên tế bào được thực hiện trên tế bào BHK-21 hoặc tế bào Vero bằng kỹ thuật tạo đám hoại tử PFU trên tế bào (phiến 6 giếng). Chủng vi rút sau khi tan đơng được pha lỗng bậc 10 từ 10-1đến 10-8. Chọn 3 độ pha loãng cuối cùng để gây nhiễm lên tế bào. Chủng vi rút được gây nhiễm lên tế bào bằng cách cấy 200l
hỗn dịch virus đã pha loãng ở trên vào mỗi giếng, mỗi độ pha 2 giếng. Cho tất cả các phiến đã cấy vào tủ ấm CO2 (36,5oC ± 0,5oC; 4,5% ± 0,5% CO2) để ủ 90 phút.Cứ 30 phút láng 1 lần.Sau đó phủ thạch và ni cấy tiếp 4 ngày trong tủ ấm CO2 (36,5oC ± 0,5oC; 4,5% ± 0,5% CO2).Khi các plaque hiện rõ, nhuộm, cố định các đám hoại tử.
Số đám hoại tử tế bào (plaque) được đếm trong mỗi giếng. Các plaque là những đốm trắng có thể nhìn thấy bằng mắt thường ở mặt đáy, đếm các plaque. Hiệu giá vi rút được tính theo cơng thức sau:
𝐻𝑖ệ𝑢 𝑔𝑖á 𝑣𝑖 𝑟ú𝑡 (𝑃𝐹𝑈) = 𝑆ố 𝑝𝑙𝑎𝑞𝑢𝑒 𝑡𝑟𝑢𝑛𝑔 𝑏ì𝑛ℎ
Độ 𝑝ℎ𝑎 𝑙𝑜ã𝑛𝑔 × 𝑠ố 𝑚𝑙 ℎỗ𝑛 𝑑ị𝑐ℎ 𝑣𝑖 𝑟ú𝑡 đã 𝑐ấ𝑦
Chuẩn độ hiệu giá vi rút trên động vật (chuột bằng phương pháp LD50)
Hiệu giá vi rút chủng gốc và chủng sản xuất vi rút Viêm não Nhật Bản được thực hiện trên chuột nhắt trắng (giống swiss hoặc ICR) 3 tuần tuổi. Chuột được chuẩn bị trước gây nhiễm 2 ngày và được chọn ngẫu nhiên với số lượng 10 con cho mỗi độ pha loãng. Chủng vi rút sau khi tan đơng được pha lỗng bậc 10 từ 10-1đến 10-9. Chọn 5 độ pha loãng cuối cùng để gây nhiễm cho chuột thí nghiệm.
Quy trình thử thách như sau:
- Sử dụng các độ pha từ 10-5 đến 10-9 để tiêm chuột - Liều tiêm: 0,03ml/1chuột
- Đường tiêm: Não
Theo dõi các dấu hiệu chuột bị nhiễm vi rút VNNB: liệt 1-2 chân trước; liệt 1- 2 chân sau, liệt 1 chân trước 1 chân sau hoặc chết...
Thời gian theo dõi động vật thí nghiệm là 14 ngày.
Theo dõi tình trạng nhiễm vi rút VNNB của chuột bắt đầu từ sau tiêm 3 ngày và ghi nhật ký tình trạng chuột hàng ngày trong thời gian theo dõi 14 ngày (chuột chết trong 2 ngày đầu loại bỏ).
Hiệu giá vi rút được tính theo cơng thức sau
𝐿𝑜𝑔𝐿𝐷50 = 𝐿𝑜𝑔𝐴 −50 − 𝑎
Hoặc
𝐿𝑜𝑔𝐿𝐷50 = 𝐿𝑜𝑔𝐴′ +50 − 𝑎
𝑏 − 𝑎 × 𝑘
Trong đó : A là độ pha lỗng của CVS(challenge virus strain) gây chết chuột ngay sát dưới 50%
A’ là độ pha loãng của CVS gây chết chuột ngay sát trên 50% a: % chuột chết ngay sát dưới 50%
b: % chuột chết ngay sát trên 50% k: Lg bậc pha loãng
Hiệu giá virus trong chủng gốc, chủng sản xuất VNNB được sử dụng để sản xuất vắc xin cần đạt ≥ 106.
2.5.6. Thử nghiệm công hiệu của vắc xin
Thử nghiệm công hiệu vắc xin Viêm não nhật bản bất hoạt được xác định dựa trên việc xác định hiệu giá kháng thể trung hòa sau tiêm miễn dịch trên chuột và thử thách trên tế bào Vero hoặc BHK-21 hoặc dòng tế bào phù hợp khác.
Các bước chính của quy trình thử nghiệm như sau:
Pha vắc xin chuẩn và vắc xin thử trong dung dịch PBS 0,02% gelatin để có độ pha 1/32.Mỗi mẫu vắc xin được tiêm phúc mạc cho một nhóm chuột nhắt trắng gồm 16 con, mỗi con 0,5 ml bằng bơm tiêm 1ml vô khuẩn với 2 mũi, mỗi mũi cách nhau 7 ngày.
Sau khi tiêm mũi thứ 2 được 7 ngày, toàn bộ chuột thử nghiệm được lấy máu tim và tách lấy huyết thanh riêng từng chuột.Huyết thanh nhóm chuột tiêm vắc xin mẫu chuẩn được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm mỗi nhóm 8 ống, sau đó chúng được hộn chung vào 1 ống và ký hiệu RA và RB.
Huyết thanh nhóm chuộttiêm vắc xin thử nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm mỗi nhóm 8 ống sau đó hộn chung vào ống ký hiệu VA và VB.
Tất cả các huyết thanh được bất hoạt 56oC /30 phút.
Huyết thanh chuẩn và huyết thanh thử được pha lỗng trong mơi trường MEM 2% FBS để có 3 độ pha là 1/80, 1/160 và 1/320.
Pha huyết thanh chứng dương lấy độ pha loãng 1/80 và 1/160. Pha huyết thanh chứng âm lấy độ pha loãng 1/10.
Pha loãng huyết thanh chứng âm 1/10:0,5 ml huyết thanh + 4,5 ml MEM 2%FBS.
Chủng thử thách (CVS) của vi rút Viêm não Nhật Bản cần đạt hiệu giá 100- 200PFU/ 200l.
Lấy 1 ml của mỗi độ pha huyết thanh được chuẩn bị trộn với 1 ml chủng CVS; 2 ml chủng CVS trộn với 2 ml MEM 2% FBS.
Hỗn hợp huyết thanh và vi rút được gây nhiễm trên tế bào Vero hoặc BHK-21 để xác định số đám hoại tử tế bào tương ứng với mỗi mẫu huyết thanh thử nghiệm. Kết quả cơng hiệu của vắc xin được tính như sau:
Tỉ lệ giảm đám hoại tử được tính theo cơng thức:
100 1 ) ( CV S Y
S: số plaque trung bình của mỗi nồng độ huyết thanh pha. CV số plaque trung bình của CV/giếng.
Hiệu giá kháng thể trung hồ được tính theo cơng thức sau:
x Z Y log10 762 , 47 50
Z: logarit của hiệu giá kháng thể trung hoà giảm 50% đám hoại tử Y: tỉ lệ giảm đám hoại tử của thử nghiệm.
x: số nghịch đảo của độ pha lỗng.
2.5.7. An tồn chung
Tính an tồn chung được đánh giá cho vắc xin thành phẩm để xác định các thành phần độc hại có thể tồn tại trong sản phẩm. Trong nghiên cứu này tính an tồn chung vắc xin Viêm não Nhật Bản được thực hiện trên 10 lô vắc xin thành phẩm.
Phương pháp thử được thực hiện theo hướng dẫn của DĐVN V, 2017, PL 15.11:“xác định tính an tồn chung cho các vắc xin, sinh phẩm sử dụng cho người”. Thử nghiệm sử dụng 2 loại động vật thí nghiệm là chuột nhắt và chuột lang. Số lượng chuột được qui định cho một mẫu thử là 2 chuột lang và 5 chuột nhắt. Đường tiêm phúc mạc và liều tiêm tương đương với 1 liều tiêm cho người nhưng không quá 1 ml đối với chuột nhắt và 5 ml đối với chuột lang. Thời gian theo dõi 7 ngày.
Thử nghiệm đạt yêu cầu khi tất cả chuột đều sống sót, khỏe mạnh và lên cân sau 7tiêm.
2.5.8. An toàn đặc hiệu
Thử nghiệm an toàn đặc hiệu được thực hiện trên chuột nhắt trắng nhằm xác định độc tính đặc hiệu liên quan đến vi rút VNNB được sử dụng để sản xuất vắc xin. Nếu vi rút chưa được bất hoạt triệt để trong qui trình sản xuất, động vật tiêm vắc xin có thể xuất hiện các dấu hiệu bệnh lý về thần kinh, não (liệt, mù, chết).
Vắc xin Viêm não Nhật Bản JECEVAX được thử nghiệm an toàn đặc hiệu bằng cách tiêm 0,03 ml vắc xin vào não chuột. Số lượng chuột thí nghiệm cho là 10 chuột/loạt vắc xin thử nghiệm. Chuột sau tiêm vắc xin được theo dõi tăng trưởng cân nặng và các dấu hiệu bệnh lý bất thường trong 14 ngày.
Sau tiêm 14 ngày, chuột thí nghiệm khỏe mạnh, tăng cân và khơng có biểu hiện bệnh lý về thần kinh, não (liệt, mù, chết) thì lơ vắc xin thử nghiệm đạt yêu cầu về tiêu chí an tồn đặc hiệu.
2.5.9. Chất gây sốt
Qui trình thử nghiệm được thực hiện trên thỏ theo hướng dẫn của DĐVN V, 2017, PL 15.12 thử chất gây sốt cho các vắc xin, sinh phẩm sử dụng cho người (chi tiết xem phụ lục 4 đính kèm).
Thử nghiệm chất gây sốt được thực hiện trên thỏ, là phương pháp sinh học dùng để đánh giá tính chất gây sốt của vắc xin, sinh phẩm dựa trên sự tăng thân nhiệt của thỏ trước và sau khi tiêm vắc xin vào tĩnh mạch tai. Nếu sau 3h tiêm vắc xin hoặc
sinh phẩm khơng có cá thể thỏ tăng nhiệt độ >0,60C và tổng số nhiệt độ chênh của 3 thỏ cộng dồn ≤ 1,30C thì mẫu thử đạt yêu cầu về tiêu chuẩn chất gây sốt.
2.5.10. Hàm lượng Thimerosal
Hàm lượng Thiomersal trong vắc xin được xác định dựa trên phản ứng tạo màu của thủy ngân tự do với Dithizone, hợp chất này có độ hấp phụ cực đại tại bước sóng 620 nm.Thử nghiệm được thực hiện theo Dược điển Việt nam V, 2017, phụ lục 15.29.
2.5.11. Hàm lượng Formaldehyde
Formaldehyde là chất dùng để bất hoạt, sử dụng trong điều chế vắc xin.Hàm lượng Formaldehyde trong mẫu được xác định bằng cách so màu của hợp chất được tạo thành do phản ứng của Formaldehyde tự do với thuốc thử Acetylacetone. Hợp chất này có màu vàng chanh và có độ hấp phụ cực đại ở bước sóng 415 nm.Thử nghiệm được thực hiện theo Dược điển Việt nam V, 2017, phụ lục 15.25.
2.5.12. Hàm lượng DNA tồn dư
Vắc xin Viêm não Nhật bản JECEVAX là vắc xin bất hoạt trên tế bào Vero. Do vậy, kiểm định tồn dư DNA của tế bào Vero trên vắc xin là cần thiết nhằm đảo bảo tính tinh sạch an tồn của vắc xin.
Quy trình xét nghiệm tồn dư DNA của tế bào Vero trong vắc xin được thực hiện bằng phương pháp lai DNA-DIG với DNA mẫu sử dụng màng nylon.
Các bước tiến hành như sau:
Xây dựng thang chuẩn DNA: Mẫu DNA chuẩn được pha trong dung dịch TE pH 8 để có 8 điểm chuẩn với lượng DNA thích hợp để đưa lên màng là: 1000, 500, 250, 100, 50, 10, 5 và 1 pg/điểm.
Tách chiết DNA từ mẫu vắc xin: DNA được tách chiết từ mẫu vắc xin cần kiểm tra Qiagen QIAamp DNA Mini Kit. Xử lý mẫu.
Nhỏ mẫu DNA lên màng:
Biến tính DNA chuẩn và DNA mẫu ở nhiệt độ 950C trong vịng 5 phút, sau đó ủ ngay vào đá 10 phút.
Nhỏ mẫu DNA kiểm tra và các mẫu DNA chuẩn lên màng nylon vào các điểm đã được đánh dấu trên màng.
Các điểm đối chứng âm tính chỉ nhỏ dung dịch TE pH 8.
Cho màng vào ống lai và bổ sung 10 ml dung dịch tiền lai (5x Denhardt's reagent, 50% (v/v) formamide, 0.5% (w/v) SDS, 100 μg/ml salmon sperm DNA, 6x SSC). Ủ ở 42oC trong vòng 5 phút. Loại bỏ, dung dịch tiền lai rồi tiếp tục bổ sung 10 ml dung dịch tiền lai mới.
Ủ ở 42oC trong vòng 30 phút.
Thay dung dịch tiền lai bằng 3,5 - 4 ml dung dịch lai (dung dịch tiền lai chứa probe gắn DIG).
Ủ ở 42oC qua đêm. Rửa màng sau lai Phát hiện DNA:
Blocking màng trong 100 ml dung dịch blocking (10% Genius Blocking Reagent in 0.1 M maleic acid and 0.15 M NaCl), lắc nhẹ trong 30 phút.
Pha loãng anti-digoxigenin-AP trong dung dịch blocking tỉ lệ 1:10000 (75mU/ml): cho 100 µl anti-digoxigenin-AP trong 100 ml dung dịch blocking, lắc nhẹ trong 30 phút.
Rửa màng 2 lần với 100 ml dung dịch rửa, mỗi lần lắc nhẹ trong 15 phút. Rửa màng với 100 ml dung dịch rửa, lắc nhẹ trong 5 phút. Loại bỏ hoàn toàn dung dịch sau khi rửa.
Nhỏ 10 ml dung dịch CSDP ready-to-use lên màng, để ở nhiệt độ phịng 5 phút. Ủ 37oC, 10 phút.
Loại bỏ hồn toàn dung dịch. Bọc nilon rồi ép phim, thời gian khoảng 15-25 phút. Rửa phim
Đánh giá kết quả dựa vào độ phát quang của mẫu thử so với mẫu DNA chuẩn để tính hàm lượng DNA tồn dư trong các mẫu.
2.5.13. Hàm lượng protein tổng số
Protein đóng vai trị là kháng ngun trong vắc xin và là các globulin miễn dịch trong các sinh phẩm. Protein trong vắc xin và sinh phẩm được xác định bằng phương pháp Lowry. Nguyên lý cơ bản của phương pháp là Protein sau khi được tách ra khỏi mẫu bằng cách tạo tủa với TCA liên kết với đồng trong dung dịch đồng alkaline tạo phức đồng – protein. Hợp chất này cho phản ứng màu với thuốc thử Folin và có độ hấp phụ cực đại ở bước sóng 750 nm.
Thử nghiệm được thực hiện theo Dược điển Việt nam V, 2017, phụ lục 15.34.
2.5.14. pH
pH đóng vai trị quan trọng trong các sinh phẩm y tế nói chung, trong vắc xin nói riêng.
Quy trình thực hiện đo pH của Vắc xin Viêm não Nhật Bản JECEVAX được thực hiện theo Dược điển Việt nam V, 2017, phụ lục 15.33.
Độ pH của mẫu vắc xin thử nghiệm được tính bằng giá trị trung bình của hai lần đo.
Thử nghiệm có giá trị khi dung dịch pH chuẩn nằm trong khoảng ± 0,01 so với giá trị của dung dịch pH chuẩn 4,01 và 7,00; và trong khoảng ± 0,02 so với giá trị của dung dịch pH chuẩn 10,01.
2.5.15. Cảm quan
Kiểm tra cảm quan vắc xin có thể quan sát được bằng mắt thường. Bao gồm kiểm tra nhãn mác, sự nguyên vẹn của bao bì, trạng thái sản phẩm, màu sắc cũng như độ trong đục và thời gian hoàn nguyên (đối với các sản phẩm đơng khơ).
Thể tích đóng ống
Thể tích đóng ống được kiểm tra bằng phương pháp đo tỷ trọng. Cụ thể: Lắc đều các lọ vắc xin (tối thiểu 3 lọ), dùng bơm tiêm sạch, hút hết vắc xin trong lọ. Bơm hết vắc xin đã hút được vào cốc sạch.