Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Nội dung 1: Nghiên cứu tạo mẫu cấy vô trùng.
Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của hóa chất khử trùng và thời gian khử trùng đến mẫu cấy.
Mẫu vật: Củ cây Địa hoàng khoảng 90 ngày tuổi.
Mẫu trƣớc tiên đƣợc rửa sạch dƣới vòi nƣớc chảy, sau đó đƣợc khử trùng thô (ở ngoài box) bằng dung dịch xà phòng loãng 1%. Rửa sạch lại bằng nƣớc và cuối cùng mẫu đƣợc tráng lại bằng nƣớc cất 3 - 4 lần. Tiếp đó, mẫu đƣợc
đƣa vào trong box cấy và khử trùng bằng hóa chất HgCl2 0,1% hoặc NaOCl 2% theo các công thức. CT1: HgCl2 0,1% trong 5 phút CT2: HgCl2 0,1% trong 10 phút CT3: HgCl2 0,1% trong 15 phút CT4: HgCl2 0,1% trong 20 phút CT5: NaOCl 2% trong 5 phút CT6: NaOCl 2% trong 10 phút CT7: NaOCl 2% trong 15 phút CT8: NaOCl 2% trong 20 phút
Mẫu cấy sau khử trùng đƣợc cấy vào môi trƣờng MS có bổ sung 30 g/l đƣờng, 7 g/l agar, pH 5,8.
Các công thức thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức thí nghiệm lặp lại ba lần, 30 mẫu/lần nhắc.
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu sạch , tỷ lệ mẫu nhiễm và tỷ lệ mẫu chết.
Tỷ lệ mẫu sạch (%) = Tổng số mẫu nảy mầm không nhiễm x 100 Tổng số mẫu ban đầu
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm x 100 Tổng số mẫu ban đầu
Tỷ lệ mẫu chết (%) =
Tổng số mẫu chết
x 100 Tổng số mẫu ban đầu
Thời điểm đánh giá: sau 2 tuần nuôi cấy.
- Nội dung 2: Nghiên cứu môi trƣờng tái sinh chồi và môi trƣờng nhân chồi.
Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của môi trƣờng nền đến sự tái sinh chồi.
Mẫu khử trùng đƣợc cấy vào các môi trƣờng cơ bản khác nhau có bổ sung 0,5 mg/l Kinetin, 30 g/l đƣờng, 7 g/l agar, pH 5,8 để đánh giá sự tái sinh chồi của mẫu theo các công thức thí nghiệm.
CT1: Môi trƣờng MS (Murashige và Skoog). CT2: Môi trƣờng Knudson
CT3: Môi trƣờng VW(Vacin và Went).
Các công thức thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức thí nghiệm lặp lại ba lần, 30 mẫu/lần nhắc.
Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu bật chồi và số chồi TB/ mẫu.
Số chồi TB/mẫu (chồi) = Tổng số chồi thu đƣợc sau 2 tuần Tổng số mẫu ban đầu Thời điểm đánh giá: sau 2 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của Kinetin đến sự nhân chồi Địa hoàng
Các chồi Địa hoàng in vitro đƣợc cấy vào các loại môi trƣờng nhân nhanh có bổ sung Kinetin với các nồng độ khác nhau theo các công thức thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ Kinetin đến sự nhân chồi in vitro. Thí nghiệm đƣợc bố trí trên môi trƣờng MS (Murashige and Skoog) bổ sung 30g/l sucrose, 7g/l agar, pH 5,8 và bổ sung Kinetin theo các công thức sau. CT1(ĐC): MS CT2: MS + 0,3 mg/l Kinetin CT3: MS + 0,5 mg/l Kinetin CT4: MS + 1,0 mg/l Kinetin CT5: MS + 1,5 mg/l Kinetin
Các công thức thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức thí nghiệm lặp lại ba lần, 30 mẫu/lần nhắc.
Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân chồi và chiều cao chồi.
Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi thu đƣợc sau 4 tuần Tổng số chồi ban đầu
Chiều cao chồi (cm) là khoảng cách từ gốc rễ đến đầu mút lá. Thời điểm đánh giá: sau 4 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng phối hợp của Kinetin và BAP đến sự nhân chồi Địa hoàng (Nồng độ Kinetin đƣợc sử dụng trong thí nghiệm là nồng độ cho kết quả tốt nhất trong thí nghiệm 3. Kí hiệu là KIN*)
Các chồi Địa hoàng đủ tiêu chuẩn đƣợc cấy vào môi trƣờng MS bổ sung 30g/l sucrose, 7g/l agar, pH 5,8 và bổ sung Kinetin và BAP theo các công thức sau.
CT1(ĐC): MS + [KIN*]
CT2: MS + [KIN*] + 0,5 mg/l BAP CT3: MS + [KIN*] + 1,0 mg/l BAP CT4: MS + [KIN*] + 1,5 mg/l BAP
Các công thức thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức thí nghiệm lặp lại ba lần, 30 mẫu/lần nhắc.
Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân chồi và chiều cao chồi. Thời điểm đánh giá: sau 4 tuần nuôi cấy.
- Nội dung 3: Nghiên cứu môi trƣờng ra rễ.
Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của IAA đến sự ra rễ Địa hoàng.
Các chồi Địa hoàng in vitro đƣợc cấy sang môi trƣờng tạo rễ ½ MS bổ sung 30g/l sucrose, 7g/l agar, pH 5,8 và bổ sung IAA theo các công thức sau.
CT1(ĐC): ½ MS
CT2: ½ MS + 0,3 mg/l IAA CT3: ½ MS + 0,5 mg/l IAA CT4: ½ MS + 1,0 mg/l IAA CT5: ½ MS + 1,5 mg/l IAA
Các công thức thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức thí nghiệm lặp lại ba lần, 30 mẫu/lần nhắc.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ cây ra rễ, số rễ TB/cây và chiều dài rễ.
Số rễ/cây (rễ) = Tổng số rễ trên các cây thí nghiệm Tổng số cây thí nghiệm
Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng phối hợp của IAAvà NAA đến sự ra rễ Địa hoàng (Nồng độ IAA đƣợc sử dụng trong thí nghiệm là nồng độ cho kết quả tốt nhất trong thí nghiệm 5. Kí hiệu là [IAA*])
CT1(ĐC): ½ MS + [IAA]*
CT2: ½ MS + [IAA]* + 0,5 mg/l NAA CT3: ½ MS + [IAA]* + 1,0 mg/l NAA CT4: ½ MS + [IAA]* + 1,5 mg/l NAA
Các công thức thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức thí nghiệm lặp lại ba lần, 30 mẫu/lần nhắc.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ cây ra rễ, số rễ TB/cây và chiều dài rễ. Thời điểm đánh giá: sau 4 tuần nuôi cấy.
2.4.2. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả thí nghiệm đƣợc xử lý thống kê theo các phƣơng pháp thống kê trong sinh học nhờ sử dụng phần mềm Microsoft Excel và IRRISTAT5.0.