a) ½MS + 0,5 mg/l IAA + 0,0 mg/l NAA; b) ½MS + 0,5 mg/l IAA + 0,5 mg/l NAA; c) ½MS + 0,5 mg/l IAA + 1,0 mg/l NAA; d) ½MS + 0,5 mg/l IAA + 1,5 mg/l NAA
a b
Khử trùng rễ củ Địa hoàng khoảng 90 ngày tuổi bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 10 - 15 phút
Vào mẫu củ Địa hoàng trên môi trƣờng MS bổ sung 0,5 mg/l Kinetin, 30 g/l đƣờng, 7 g/l agar
Giai đoạn nhân nhanh chồi Địa hoàng in vitro trên môi
trƣờng MS bổ sung 0,5 mg/l Kinetin và 1,0 mg/l BAP, 30 g/l đƣờng, 7,0 g/l agar
Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh: Địa hoàng in vitro trên
môi trƣờng ½MS bổ sung 0,5 mg/l IAA và 1,0 mg/l NAA, 30 g/l đƣờng, 7g/l agar
Hình 3.21. Sơ đồ quy trình nhân giống in vitro cây Địa hoàng giai đoạn phòng thí nghiệm
KẾT LUẬN
1. Đã xây dựng đƣợc quy trình nhân giống in vitro cây Địa hoàng giai đoạn phòng thí nghiệm.
2. Khử trùng rễ củ Địa hoàng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 10 - 15 phút là thích hợp nhất, tỷ lệ mẫu sống đạt 82,22 - 83,33%.
3. Môi trƣờng nền nảy chồi tốt nhất của lát cắt Địa hoàng là MS có bổ sung 0,5 mg/l Kinetin, 30 g/l đƣờng, 7 g/l agar cho tỷ lệ mẫu bật chồi đạt 83,33% và số chồi/mẫu đạt 6,56.
4. Môi trƣờng nhân nhanh chồi Địa hoàng in vitro khi bổ sung Kinetin tốt nhất là MS có bổ sung 0,5 mg/l Kinetin 30 g/l đƣờng, 7,0 g/l agar cho cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,22 lần. Chiều cao chồi tăng trƣởng mạnh nhất đạt 3,11 cm.
5. Môi trƣờng nhân nhanh chồi Địa hoàng in vitro tốt nhất khi bổ sung kết hợp Kinetin và BAP là MS có bổ sung 0,5 mg/l Kinetin và 1,0 mg/l BAP, 30 g/l đƣờng, 7,0 g/l agar cho cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 7,12 lần. Chiều cao chồi tăng trƣởng mạnh nhất đạt 3,64 cm.
6. Môi trƣờng ra rễ của Địa hoàng in vitro tốt nhất khi bổ sung IAA là ½MS bổ sung 0,5 mg/l IAA, 30 g/l đƣờng, 7g/l agar cho tỷ lệ cây ra rễ đạt 85,56 %, số rễ TB/cây đạt 5,74 rễ, chiều dài rễ đạt 4,16 cm.
7. Môi trƣờng ra rễ của Địa hoàng in vitro tốt nhất khi kết hợp bổ sung IAA và NAA là ½MS bổ sung 0,5 mg/l IAA và 1,0 mg/l NAA, 30 g/l đƣờng, 7g/l agar cho tỷ lệ cây ra rễ đạt 94,44%, số rễ TB/cây đạt 6,96 rễ, chiều dài rễ đạt 4,52 cm.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây Địa hoàng giai đoạn ra ngôi.
2. Nghiên cứu môi trƣờng nhân nhanh Địa hoàng in vitro khi bổ sung
thêm TDZ ở các nồng độ khác nhau hoặc phối hợp bổ sung Kinetin, BAP và TDZ.
3. Nghiên cứu môi trƣờng ra rễ Địa hoàng in vitro khi bổ sung thêm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
1. Đỗ Tất Lợi (2012), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học, nhà xuất bản thời đại.
2. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Trƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong, Đỗ Trung Đàm (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 1, NXB khoa học kỹ thuật, 774-781.
3. Nguyễn Bá Hoạt, Nguyễn Duy Thuần (2005), Kỹ thuật trồng, sử dụng và chế biến cây thuốc, NXB Nông Nghiệp, 74-84.
4. Ngô Xuân Bình (2009), Nuôi cấy mô tế bảo thực vật, cơ sở lý luận và ứng dụng, NXB Khoa học và kỹ thuật, 34-41.
5. Trịnh Thùy Dƣơng (2015), Nghiên cứu bệnh thối gốc trên cây sinh địa (Rhemannia glutinosa Libosch.) và đề xuất một số biện pháp phòng trừ bệnh tại Bắc Giang, Luận văn thạc sỹ Nông nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Tài liệu Tiếng Anh
6. Albach DC, Li HQ, Zhao N and Jensen SR (2007), “Molecular systematics and phytochemistry of Rehmannia (Scrophulariaceae)”, Biochem. Systematics Ecol, 35: 293-300.
7. Bajai YPS (1988), “Biotecnology in Agriculture and Forestry 4, Medicinal and Aromatic plants I”,Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 501-511.
8. Cui YY, Hahn EJ, Kozai T, Paek KY (2000), “Number of air exchanges, sucrose concentration, photosynthetic photon flux, and diffirences in photoperiod and dark period temperatures affect growth of Rehmannia glutinosa
plantlets in vitro”Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 62: 219-226.
9. Ewelina P, Izabela GK (2014), “Micropopagation of Rehmannia glutinosa
Libosch.: production of phenolics and flavonoids and evaluation of antioxidant activity”, Acta Physiol Plant, 36: 1693-1702.
10. Ewelina P, Lukasz K, Przemyslaw S, Halina W (2015), “Shoot organogenesis, molecular analysis and secondary metabolite production ofmicropropagated Rehmannia glutinosa Libosch”, Plant Cell Tiss Organ Cult, 120: 539-549.
11. Huang KC (1993), “The Pharmacology of Chinese Herbs”, CRC Press, Amsterdam, 281.
12. Kim HM, An CS, Joug KY, Choo YK, Park JK, Nam SY (1999), “Rhemania glutinosa inhibits tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1 secretion from mouse astrocyte”,Pharmacol. Res., 40: 171-176.
13. Liu CH, Zhang LJ and Li GS (2002), “Determination of rehmannioside A in root tuber of Rehmannia glutinosa”,Chinese Traditional Herbal Drugs, 33: 706- 707.
14. Mao WY, Li XG, Zhu BM (1983), “Studies on the meristern culture of
Rehmannia glutinosa”,Chin Bull Bot, 1: 44-46.
15. Park SU, Kim YK and Lee SY (2009), “Improved in-vitro plant regeneration and micro- propagation of Rehmannia glutinosa L”, J. Medicinal Plants Res., 3(1): 031-034.
16. Shoyama W, Tubek B, Nishioka I (1983), “Clonal multiplication of R. glutinosa”,Planta Med, 48: 124-128.
17. Xue T, Guo L, Xue JP, Song YX, Lu HD, Zhang AM et al (2012), “Study of the system of tuberous root induction in vitro from Rehmannia glutinosa.
African Journal of Biotechnology”, 11(28): 7202-7207.
18. Xu and Davey (1983), “Shoot Regeneration from Mesophyll Protoplasts and Leaf Explants of Rehmannia glutinosa”, Plant Cell Rep, 2: 55-57.
PHỤ LỤC 1 THÀNH PHẦN CÁC CHẤT TRONG MÔI TRƢỜNG Nhóm các chất Tên chất Hàm lƣợng các chất trong môi trƣờng (mg/l) MS K V Khoáng đa lƣợng NH4NO3 1650 600 - (NH4)2SO4 - - 500 CaCl2 332 453 - Ca3(PO4)2 - - 200 MgSO4.7H2O 180.7 146.5 122.1 KNO3 1900 1900 525 Ca(NO3)2.2H2O - - - KH2PO4 170 170 250 KCl - 300 - EDTA 37,3 37,26 - Khoáng vi lƣợng FeSO4.7H2O 27,8 27,8 - Ferric tatrate.2H2O - - 28 MnSO4 16,9 10 5,078 ZnSO4.7H2O 8,6 2 - H3BO3 6,2 3 - Na2MoO4 0,25 0,25 - KI 0,83 0,75 - CoCl2.6H2O 0,025 0,025 - CuSO4.5H2O 0,025 0,025 - Vitamin Myo inositol 100 - - Glycin 2 - 0,4 Thiamin. HCl 0,1 - - Pyridoxine. HCl 0,5 - - Nicotic acid 0,5 - -
PHỤ LỤC 2
M T SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU
Củ Địa hoàng Thao tác khử trùng
Thao tác vào mẫu Địa hoàng sau 5 ngày vào mẫu
Thao tác cấy chuyển chồi vào môi trƣờng nhân nhanh
Địa hoàng in vitro trong môi trƣờng nhân nhanh
Địa hoàng in vitro sau 2 tuần cấy vào môi trƣờng nhân nhanh
Địa hoàng in vitro trong môi trƣờng ra rễ
Sự ra rễ của Địa hoàng in vitro sau 4 tuần nuôi cấy
PHỤ LỤC 3 3.1. Phụ lục 1: Kết quả xử lý số liệu thí nghiệm 1
BALANCED ANOVA FOR VARIATE MSONG FILE 1 4/ 5/17 11: 9
--- :PAGE 1
Thi nghiem thiet ke theo kieu hoan toan ngau nhien VARIATE V003 MSONG
LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 7 2425.29 346.470 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 16 1.33358 .833486E-01 --- * TOTAL (CORRECTED) 23 2426.63 105.505 --- BALANCED ANOVA FOR VARIATE MNHIEM FILE 1 4/ 5/17 11: 9
--- :PAGE 2
Thi nghiem thiet ke theo kieu hoan toan ngau nhien VARIATE V004 MNHIEM
LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 7 2722.96 388.994 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 16 1.99991 .124995 --- * TOTAL (CORRECTED) 23 2724.96 118.476 --- BALANCED ANOVA FOR VARIATE MCHET FILE 1 4/ 5/17 11: 9
--- :PAGE 3
Thi nghiem thiet ke theo kieu hoan toan ngau nhien VARIATE V005 MCHET
LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 7 370.667 52.9524 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 16 .666711 .416694E-01 --- * TOTAL (CORRECTED) 23 371.333 16.1449 --- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 1 4/ 5/17 11: 9
--- :PAGE 4
Thi nghiem thiet ke theo kieu hoan toan ngau nhien MEANS FOR EFFECT CT$
--- CT$ NOS MSONG MNHIEM MCHET
CT1 3 9.00000 21.0000 0.000000 CT2 3 24.6667 4.33333 1.00000 CT3 3 25.0000 1.00000 4.00000 CT4 3 21.3333 0.666667 8.00000 CT5 3 0.000000 30.0000 0.000000 CT6 3 2.00000 25.0000 3.00000 CT7 3 4.00000 20.6667 5.33333 CT8 3 3.00000 15.0000 12.0000 SE(N= 3) 0.166682 0.204120 0.117855 5%LSD 16DF 0.499715 0.611954 0.353331 --- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 1 4/ 5/17 11: 9
--- :PAGE 5
Thi nghiem thiet ke theo kieu hoan toan ngau nhien F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1
VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 24) --- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | MSONG 24 11.125 10.272 0.28870 2.6 0.0000 MNHIEM 24 14.708 10.885 0.35355 2.4 0.0000 MCHET 24 4.1667 4.0181 0.20413 4.9 0.0000
3.2. Phụ lục 2: Kết quả xử lý số liệu thí nghiệm 2
BALANCED ANOVA FOR VARIATE MBAT FILE TN2 31/ 3/17 21:17
--- :PAGE 1
Thi nghiem thiet ke theo kieu hoan toan ngau nhien VARIATE V003 MBAT
LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 28.6667 14.3333 64.50 0.000 2 * RESIDUAL 6 1.33333 .222222 --- * TOTAL (CORRECTED) 8 30.0000 3.75000 --- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOCHOI FILE TN2 31/ 3/17 21:17
--- :PAGE 2