Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Địa hoàng (Rehmannia glutinosa) là một loại thảo dƣợc đã đƣợc sử dụng lâu năm tại các nƣớc Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, là một trong 50 loại thảo dƣợc cơ bản và quan trọng trong Danh mục thuốc thực vật đƣợc sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc.
Dịch chiết từ củ loài R. glutinosa có chứa cao tạo thành các chất hợp chất catalpol, danmelittoside, leonuride, aucubin, melittoside, rehmaglutin…
[6]. Củ loài R. glutinosa có tác dụng bổ máu, tăng cƣờng hệ thống miễn dịch, rối loại nội tiết tố (điều trị hội chứng mãn kinh), bảo vệ tim mạch [13]. Củ loài R. glutinosa có tác dụng chữa các rối loạn về gan và thận, sốt cao và chứng ra mồ hôi đêm [12]. Ngoài ra còn có tác dụng cầm máu, làm tan cục máu đông, lợi tiểu, chống viêm [11]. Hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất đạt đƣợc 51% với dịch chiết rễ địa hoàng bằng acetone. Khả năng ức chế α- glucosidase đạt đƣợc hơn 90% khi sử dụng dịch chiết methanol 60-80%. Vì vậy, củ loài R. glutinosa đang có nhu cầu cao trên thị trƣờng.
Kỹ thuật nhân giống bằng củ
Thông thƣờng Địa hoàng đƣợc nhân giống bằng củ. Mầm củ thƣờng mọc vào mùa xuân ở nhiệt độ thích hợp từ 18-25oC. Sau khi trồng 35-45 ngày, cây bắt đầu ra rễ củ và rễ phát triển nhanh chóng vào cuối tháng 7 đến giữa tháng 10, sau 140 ngày có thể thu hoạch củ Địa hoàng [7]. Thực tế trong sản xuất, củ Địa hoàng thƣờng bị nhiễm virus và nấm làm ảnh hƣởng trực tiếp đến năng suất và chất lƣợng củ Địa hoàng. Bên cạnh đó việc nhân giống bằng hạt không thể thực hiện đƣợc do tỷ lệ nhân giống thấp, chất lƣợng cây giống kém [15]. Cây Địa hoàng ngày càng bị thoái hóa do bị nhiễm virus, nấm bệnh hay do nhân giống sinh dƣỡng liên tiếp qua nhiều thế hệ. Năng suất củ giảm cũng do trình độ canh tác của nông dân, đồng thời việc thƣờng chọn các củ lớn để bán, những củ nhỏ dùng để làm giống cũng làm ảnh hƣởng đến năng suất [7].
Chính vì vậy việc tuyển chọn giống Địa hoàng bằng những củ giống tốt, thuần chủng, cho năng suất cao và áp dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật vào thực hiện nhân giống để tạo ra nguồn giống tốt, chất lƣợng cao là vấn đề cần quan tâm.
Nghiên cứu nhân giống in vitro cây địa hoàng
Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh có thể loại bỏ hoàn toàn đƣợc virus ra khỏi cây giống. Mô phân sinh đỉnh từ 1 - 2 lá cây R. glutinosa đƣợc khử trùng bề mặt và cấy lên môi trƣờng MS bổ sung 0,3 - 0,4 mg/l BAP, 0,02 mg/l NAA và 0,1 mg/l GA cho tỷ lệ cây sống đạt 100% và sau 30 ngày cây cho chồi mới. Nhân nhanh chồi trên môi trƣờng MS có bổ sung 2 mg/l BAP và rễ đƣợc tạo thành trên môi trƣờng MS bổ sung 0,2 mg/l IAA hoặc không bổ sung [14].
Tế bào trần của R. glutinosa đƣợc tạo thành từ lá của cây nuôi cấy mô và nuôi trong môi trƣờng MS chứa 2 mg/l NAA và 0,5 mg/l BAP hiệu quả tạo thành mô sẹo đạt 27%. Chồi đƣợc tạo thành trên môi trƣờng MS có bổ sung 2 mg/l IAA và 1 mg/l BAP [18]. Môi trƣờng MS bổ sung 1 m/l TDZ, 3 g/l Gelrite và 0,1 mg/l NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 2,1 lần và chiều cao chồi đạt 1,2 cm.
Sự nhân chồi của R. glutinosa đạt đƣợc tốt nhất trong môi trƣờng MS bổ sung 1,0 mg/l BAP và 0,1 mg/l IAA. 80% số mầm cho ra chồi và trung bình đạt đƣợc 8 chồi/mầm sau 4 tuần nuôi cấy [9]. Tuy nhiên Shoyama (1983) đã công bố rằng hệ số nhân chồi của R. glutinosa var. purpurea Makino đạt 20
chồi/mầm khi sử dụng nồng độ BAP 5 mg/l [16].
Đỉnh chồi của cây in vitro đƣợc đƣa vào nuôi cấy trong hệ thống
Bioreactor quy mô 5 lít trong môi trƣờng MS có bổ sung 1,0 mg/l BAP và 0,1 mg/l IAA cho thấy số chồi đạt đƣợc trung bình 21 chồi/mầm cao hơn hẳn so với nhân trong ống nghiệm chỉ đạt 8 chồi/mầm [9]. Các chồi đạt tiêu chuẩn đƣợc cấy chuyển vào môi trƣờng MS bổ sung 0,1 mg/l IAA, sau 6 tuần nuôi cấy tỷ lệ chồi ra rễ đạt 93%, số rễ trung bình/chồi đạt 5 rễ và chiều dài trung bình rễ đạt 44 mm [10]. Nồng độ đƣờng sucrose cao 30 g/l sẽ làm tăng khối lƣợng của rễ nhƣng lại làm giảm sự phát triển của chồi [8].
Theo Ewelina và cs (2014), sử dụng TDZ cho hệ số nhân chồi đạt cao hơn các loại Cytokinin khác cho 12,25 chồi/mẫu khi nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung 1,0 mg/l TDZ. Tuy nhiên chất lƣợng chồi không tốt bằng chồi nhân trên môi trƣờng có BAP hoặc Kinetin. Việc bổ sung BAP và Kinetin vào môi trƣờng nuôi cấy làm tăng chất lƣợng chồi, nhƣng giảm hệ số nhân chồi còn 3-4 chồi/mẫu. Nuôi cấy chồi trong môi trƣờng MS bổ sung 0,1 mg/l IAA và 1,0 mg/l BAP sau 2 tuần cây con bắt đầu ra rễ và sau 6 tuần cây hoàn thiện bộ rễ; nuôi cấy trong hệ thống bioreacter sự ra rễ của chồi tốt hơn nuôi cấy trong ống nghiệm, trong điều kiện này, 93% số chồi cho bộ rễ hoàn chỉnh, trung bình đạt 5,3 rễ/chồi và chiều dài rễ đạt 21 mm. Rễ cũng đƣợc hình thành trong môi trƣờng không có auxin, nhƣng với tần số thấp hơn sau 6 tuần chỉ đạt 65-80% số
chồi ra rễ và đạt 3-5 rễ/chồi. Tất cả các chồi ra rễ đều sống sau 8 tuần huấn luyện cây [9].
Chồi cấy trên môi trƣờng MS không có auxin sau 2 tuần cây bắt đầu ra rễ và bộ rễ hoàn chỉnh sau 6 tuần nuôi cấy; 60% số chồi ra rễ và trung bình đạt 4 rễ/chồi. Khi bổ sung auxin vào môi trƣờng MS làm tăng tỷ lệ số chồi ra rễ và chiều dài rễ. Môi trƣờng tối ƣu ra rễ đạt đƣợc trên môi trƣờng MS bổ sung 0,1 mg/l IAA, 93% số chồi ra rễ và chiều dài rễ đạt 44 mm sau 6 tuần nuôi cấy. Giá trị này thấp hơn trong môi trƣờng có bổ sung 0,1 mg/l IBA đạt 83% số chồi ra rễ và chiều dài trung bình của rễ đạt 37 mm. Cây con đƣợc huấn luyện trong giá thể đất, cát hoặc than bùn, sau hai tuần trong phòng di chuyển ra nhà kính sau 10 tuần theo dõi tỷ lệ cây sống đạt 95% [9].
Xue và cs (2012) nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng, nguồn sucrose, chất điều hòa sinh trƣởng auxin và cytokinin đến quá trình hình thành củ trong ống nghiệm của cây Địa hoàng. Kết quả cho thấy, môi trƣờng ¼MS đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành củ rễ, nồng độ NAA tăng từ 0,05-0,15mg/l làm tăng trọng lƣợng trung bình của củ rễ [17].
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Theo Nguyễn Bá Hoạt và Nguyễn Duy Thuần (2005): Địa hoàng (Rehmannia glutinosa Libosch.) thuộc họ Hoa mõm sói (Scrophulariaceae), tên vị thuốc: Sinh địa, Thục địa. Địa hoàng là cây thân thảo, sống hàng năm, toàn thân cây có lông trắng mềm. Cây cao từ 30-35 cm. Lá mọc vòng ở gốc, phiến lá hình trứng ngƣợc đến bầu dục dài, đuôi lá tù, mép lá có răng cƣa không đều nhau, lá có nếp nhăn. Hoa tự chùm ở ngọn, đài hình chuông, 5 cánh giống nhƣ hình môi, mặt ngoài màu tím đỏ, mặt trong màu vàng có vân tím. Cây trồng vụ nào cũng có hoa, nhƣng không kết hạt. Địa hoàng thuộc loại cây rễ củ, mỗi cây có 5-7 củ, củ có cuống dài, vỏ củ màu đỏ nhạt. Mùa hoa tháng 5-6.
Việt Nam đã tiến hành nhập nội Địa hoàng từ năm 1958 và trồng thử nghiệm tại các tỉnh: Hải Dƣơng, Hƣng Yên, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Nam, Nam Định, Ninh Bình, Thái Bình, Vĩnh Phúc, ngoại thành Hà Nội. Năm
1980-1983 cây Địa hoàng đƣợc trồng thử nghiệm ở các tỉnh Đắc Lắc, Bình Định, Khánh Hòa nhƣng cho năng suất thấp [5].
Thời gian sinh trƣởng của cây Địa hoàng từ 150-180 ngày và củ không có thời gian ngủ nghỉ, củ giống 5-6 tháng tuổi thƣờng bị nhiễm bệnh, già hóa, mất sức sống, năng suất thấp nên thƣờng trồng Địa hoàng thành 2 vụ liên tiếp, một vụ giống từ tháng 2 thu hoạch tháng 7 và một vụ dƣợc liệu từ tháng 8 đến tháng 2 năm sau [3].
Năng suất Địa hoàng trồng ở Việt Nam dao động trong khoảng 12 tấn/ha, nên cần phải sản xuất theo hƣớng thâm canh, chọn thời vụ tối ƣu, đảm bảo năng suất ổn định ở mức từ 15 - 16 tấn/ha thì mới có thể cạnh tranh đƣợc với các sản phẩm của Trung Quốc [2].
Chƣơng 2. ĐỐI TƢ NG, PHẠM VI, N I DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU