CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.2. Vắcxin Viêmnão Nhật Bản
1.2.3. Các biến thể di truyền và kháng nguyên trong virút VNNB và việc tiêm
phòng[34]
Việc sử dụng chủng vi rút VNNB thuộc genotype III (GIII) để sản xuất vắc xin VNNB đến nay đã giúp thế giới đẩy lùi, giảm tỷ lệ bị mắc bệnh VNNB một cách đáng kể.
Tuy nhiên, trong 2 thập kỷ qua, việc thay thế chủng vi rút VNNB lưu hành trên người từ GIII bằng GI đã được quan sát thấy ở một số nơi[35, 36]. Một nghiên cứu gần đây ở người cho thấy hiệu quả trung hòa giảm đi đối với GI bằng các kháng
thể gây ra bởi JE-VAX (genotype III)[37]. Trong một nghiên cứu tương tự, đáp ứng miễn dịch thấp hơn so với các dòng GI và GIV, khi các đối tượng được tiêm vắc xin dựa trên GIII. Trong một nghiên cứu khác, chủng vi rút VNNB của GI đã được phân lập từ dịch não của một bệnh nhân đã được chủng ngừa với SA14-14-2 (GIII)[38]. Đây có thể là một thách thức lớn đối với việc chủng ngừa vì các vắc xin được cấp phép hiện nay đều dựa trên chủng GIII (Nakayama, Beijing-1, Beijing-3, và SA14- 14-2). Vấn đề trở nên phức tạp hơn như trong một số nghiên cứu còn cho thấy giảm khả năng kháng thể trung hòa đối với các dòng GIII khác nhau cũng đã được quan sát thấy khi các đối tượng được chủng ngừa với JE-VAX, SA14-14-2 và IC51[39, 40, 41, 42]. Cho nên việc tiếp tục nghiên cứu phát triển vắc xin này vẫn cần thiết và được nhiều nhà khoa học quan tâm.
1.2.4. Đánh giá chất lượng an tồn và tính sinh miễn dịch của vắc xin
Tính an tồn của vắc xin trên quy mơ phịng thí nghiệm[22, 43]: Tính an tồn
của vắc xin được kiểm sốt qua các tiêu chuẩn về tính an tồn trên động vật thí nghiệm (thử chất gây sốt, an tồn chung, an tồn đặc hiệu), tính vơ khuẩn và các đặc tính hóa lý của vắc xin. Tính an tồn của vắc xin được đánh giá qua các phản ứng tại chỗ như: Sốt, đau sưng, đau cơ, nổi ban … đến các biểu hiện nặng hơn như đau đầu, suất xuất huyết não, co giật, biếng ăn, ít vận động, tử vong… để kiểm sốt hết các tính khơng an tồn (phản ứng phụ) này, chúng ta phải đánh giá qua 1 số thử nghiệm trên động vật (in vivo) và trong phong thí nghiệm (in vitro). Những thử nghiệm này đều là những thử nghiệm trong danh sách được tổ chức y tế thế giới (TCYTTG - WHO TRS 963) khuyến cáo phải thực hiện để đảm bảo tính an tồn cho vắc xin nói chung và vắc xin VNNB nói riêng. Tồn bộ quy trình thực hiện đều là các quy trình chuẩn theo dược điển đồng thời cũng được thẩm định bài bản trước khi tiến hành; người thực hiện đều được đào tạo bài bản, có thâm niên, kinh nghiệm cho từng thử nghiệm liên quan. Từng thử nghiệm cũng được phân về các khoa chuyên môn như thử nghiệm sinh học thì nhóm chun sâu về sinhhọc thực hiện; thử nghiệm hóa lý thì nhóm chun sâu về hóa lý thực hiện… nên kết quả thu được rất đáng tin cậy.
Tính an tồn trên động vật thí nghiệm:Ba loại động vật như chuột nhắt trắng,
nay vẫn đang dùng thử nghiệm đánh giá tính an tồn của vắc xin, sinh phẩm và thuốc. Các động vật này tùy theo yêu cầu của thử nghiệm mà sử dụng đường tiêm, liều tiêm, loại động vật và có các tiêu chí đánh giá riêng.
Thử nghiệm kiểm tra chất gây sốt (pyrogens test) trên thỏ giúp ta kiểm sốt các tác nhân có thể tạp nhiễm trong q trình sản xuất vắc xin mà có thể gây sốt như: Nội độc tố của vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương, vi rút, nấm mốc, nấm men, các hạt bụi khác từ môi trường xung quanh.
Chọn thỏ vì thỏ là động vật rất nhậy cảm với nhiệt độ và chọn đường tĩnh mạch để quá trình phát hiện được nhanh, chuẩn xác nhất. Nếu vắc xin có tạp nhiễm hoặc tinh sạch khơng tốt, sau 3h tiêm, nhiệt độ của thỏ sẽ tăng > 1,3oC so với trước tiêm. Như vậy vắc xin sẽ không được phép sử dụng để tiêm cho người.
Thử nghiệm an tồn chung (hay an tồn khơng đặc hiệu) trên động vật: Chọn chuột nhắt trắng và chuột lang vì đây là 2 loại động vật rất nhậy cảm, giúp phát hiện nhanh khi vắc xin có các tạp nhiễm, chất tồn dư gây các phản ứng phụ khơng an tồn khác - trừ vi rút VNNB. Nếu chất tiêm (vắc xin) khơng an tồn, chuột sẽ xù lơng, hóp bụng, nằm bẹp, ít vận động, ăn uống giảm sút dẫn đến giảm cân hoặc chết… Nên đây là một trong các thử nghiệm rất quan trọng để đảm bảo tính an tồn khi tiêm vắc xin trên người.
Hình 1.2. Các tác nhân gây sốt
(https://bioprocessintl.com/analytical/downstream-validation/detecting-the-broad- spectrum-of-pyrogens-with-the-human-whole-blood-monocyte-activation-test/)
Thử nghiệm an tồn đặc hiệu trên động vật: Nếu q trình bất hoạt vi rút chưa đạt tiêu chuẩn có thể dẫn đến các biểu hiện trên chuộtcác triệu chứng đặc trưng của
Vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương
Các tác nhân gây sốt Vi rút, nấm mốc, nấm men Hóa chất
VNNB như liệt hoặc mù lịa, xù lơng và nặng có thể chết. Nên đây cũng là một trong các chỉ tiêu rất được quan tâm và cần phải kiểm sốt nghiêm ngặt để đảm bảo an tồn cho vắc xin khi sử dụng trên người.
Tính an tồn qua các chỉ tiêu lý-hóa tại phịng thí nghiệm
Cảm quan: Là đánh giá tính nguyên vẹn của ống mẫu (nhãn mác, sự nguyên vẹn của bao bì, trạng thái sản phẩm, màu sắc cũng như độ trong đục, vật thể lạ (nếu có)của vắc xin qua quan sát bằng mắt thường. Tùy theo thành phần của từng vắc xin mà tiêu chuẩn cảm quan sẽ là đặc trưng riêng. Chỉ tiêu này giúp chúng ta kiểm soát các tạp nhiễm hoặc dấu hiệu bất thường khác như tiêu chuẩn mô tả/đăng ký, nếu chỉ tiêu này không đạt thì khơng cần tiến hành các thử nghiệm khác và hủy không sử dụng vắc xin. Nên đây cũng là 1 trong các chỉ tiêu quan trọng và bắt buộc mà TCYTTG khuyến cáo cho vắc xin VNNB.
Thể tích đóng ống: Giúp kiểm sốt lượng thể tích mẫu trong từng lọ vắc xin, đảm bảo đủliều tiêm như tiêu chuẩn đã đăng ký và đượcghi trên nhãn. Nếu không đủ là do phân liều hoặc đóng ống hoặc ống chứa bị lỗi dẫn đến thiếu hụt vắc xin trong lọ cũng không được dùng. Đây cũng là 1 trong các chỉ tiêu bắt buộc mà TCYTTG khuyến cáo cho vắc xin VNNB.
Vơ trùng: Giúp kiểm sốt tạp nhiễm về vi khuẩn và vi nấm (nếu có) trong vắc xin.Vắc xin kiểm tra không đạt vô trùng lô vắc xin phải hủy. Nên đây cũnglà 1 trong các chỉ tiêu bắt buộc mà TCYTTG khuyến cáo cho vắc xin VNNB và tất cảcác vắc xin khác.
Hàm lượng Thimerosal: Chất bảo quản giúp kéo dài hạn dùng cho vắc xin.Đây là chất có chứa thủy ngân nên hàm lượng sử dụng cần được kiểm soát chặt chẽ ở dạng vi lượng ≤ 120 µg/ml. Tuy nhiên khuyến cáo chung của TCYTTG hàm lượng nàycàng thấp càng tốt để các phản ứng quá mẫnkhông xảy ra.
Hàm lượng Formaldehyde: Đây là chất dùng để bất hoạt vi rút tồn dư, do đó cần được kiểm sốt để khơng bị vượt quá giới hạn gây mất an toàn cho người dùng.TCYTTG cho phép tiêu chuẩn formaldehyde tồn dư của vắc xin bất hoạt là ≤ 10 µg/ml.
Hàm lượng Proteintổng số: Cần được kiểm sốt để khơng bị vượt q giới hạn gây phản ứng phụ, mất an toàn cho người dùng. Quy định của TCYTTG về hàm lượng protein tổng số cho vắc xin bất hoạt là ≤ 80 µg/ml.
DNA tồn dư: là DNA của tế bào ni cấy vi rút (Vero), việc kiểm sốt hàm lượng DNA tồn dư là rất quan trọng và cần thiết để tránh quá trình sao chép, nhân bản DNA của tế bào này khi vào cơ thể người, gây nguy cơ đột biến gen hoặc ung thư….yêu cầu chung của TCYTTG về hàm lượng AND tồn dư trong vắc xin nuôi cấy tế bào là ≤ 10 ng/ml.
pH: là 1 chỉ số rất quan trọng để đánh giá tính ổn định của vắc xin. Mỗi vắc xin có một giới hạn cho pH để đảm bảo tính an tồn và hiệu quả cho vắc xin đến hạn sử dụng. Với vắc xin VNNB tiêu chuẩn pH thường từ 6,8-7,4.
Tính sinh miễn dịchcủa vắc xin trên quy mơ phịng thí nghiệm[22, 43]
Đây là một chỉ số quan trọng nhất đánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc xin, trong chuyên ngành gọi là thử nghiệm công hiệu.Nếucông hiệucủa vắc xin không đạt tức tính sinh miễn dịch ở quy mơ phịng thí nghiệm của vắc xin khơng đạtthì vắc xin không được cấp phép đưa vào sử dụng.Cơng hiệu có cơng hiệuin vivo (đánh giá tính sinh miễn dịch hoặc hiệu quả tạo kháng thể đặc hiệu đối với chính vi rút/bệnh đó) và cơng hiệuin vitro (định lượng hàm lượng kháng nguyên đủ để tạo đáp ứng miễn dịch).Trong giai đoạn nghiên cứu phát triển vắc xin, tính sinh miễn dịch trên động vật là một thử nghiệm được quan trọng vì cần có đủ hàm lượng kháng nguyên là tạo được kháng thể bảo vệ như mong muốn ...Với vắc xin VNNB bất hoạt, thử nghiệm công hiệu chuẩn thức theo khuyến cáo của TCYTTG (WHO TRS 962) vẫn là đánh giá tính sinh miễn dịch trên chuột.
Đánh giá tính sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm được tiến hành đồng thời với vắc xin mẫu chuẩn: Pha vắc xin thử và mẫu chuẩn, gây miễn dịch, lấy máu tim, tách huyết thanh, xử lý huyết thanh vàđánh giáHGKTTHbằngphương pháp trung hòa giảm 50% đám hoại tử (PRNT50).
Theo quy định của TCYTTG thì HGKTTH giữa mẫu vắc xin thử nghiệm/mẫu chuẩn phải ≥ 1 là đạt yêu cầu. Một số nhà sản xuất chưa có vắc xin mẫu chuẩn, cơng
hiệu của vắc xin đạt yêu cầu khi HGKTTH≥ 1,5 log. Vắc xin Jevac (Biken, Nhật ) chỉ cần HGKTTH của vắc xin ≥1,3 log là đạt yêu cầu.
1.3. Chủng vi rút sản xuất vắc xin Viên não Nhật Bản
1.3.1. Chủng vi rút Nakayama-NIH
Nhật Bản là nước đầu tiên phân lập được vi rút VNNB năm 1935 từ một em bé bị VNNB, đặt tên chủng là Nakayama. Nhật Bản cũng là nước đầu tiên sản xuất vắc xin phòng bệnh VNNB, chủng Nakayama được chọn làm chủng sản xuất vắc xin trong số các chủng phân lập được ở Nhật Bản[13, 20].
Tác giả Aizawa và cs., Han và cs. đã chứng minh đáp ứng kháng thể khác nhau giữa chủng Nakayama-NIH và nhiều chủng khác bằng kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử (PRNT). Từ đó đã chọn được 5 chủng: Nakayama-NIH, Nakayama Yokken, JaGar-01, Yokoshiba (YS) và T8 để sản xuất vắc xin.
Hai chủng Nakayama-NIH và Nakayama Yokken có nguồn gốc như nhau. Ở Nhật Bản dùng chủng Nakayama-NIH để sản xuất vắc xin cho người và chủng Nakayama Yokken sản xuất vắc xin cho động vật. Nhiều tác giả đã chứng minh rằng chủng Nakayama-NIH đạt được tất cả các tiêu chuẩn để sản xuất vắc xin và ở Nhật Bản. Từ năm 1989, 2 chủng Nakayama-NIH và chủng Beijing-1 được sử dụng đồng thời để sản xuất vắc xin phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu theo yêu cầu đặt hang [44].Ngoài Nhật Bản, chủng Nakayama đã được một số nước chọn để sản xuất vắc xin cho người như Hàn Quốc, Thái Lan, Việt Nam…
1.3.2. Chủng vi rút Beijing-1
Chủng Beijing-1 được phân lập từ người năm 1949 ở Bắc Kinh, Trung Quốc.Tại Trung Quốc, chủng Beijing-1 được cấy truyền 70 đời và đạt được tất cả các tiêu chuẩn như chủng Nakayama nên được sử dụng để sản xuất vắc xin trong nhiều năm qua. Nhật Bản bắt đầu sử dụng chủng Beijing-1cùng với chủng Nakayama –NIH để sản xuất vắc xin VNNB cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu từ năm1989[45, 46]. Các cơng trình nghiên cứu của Kurane và Takasaki dựa trên kết quả của các nghiên cứu, thử nghiệm khác nhau cho thấy đáp ứng miễn dịch của vắc xin VNNB sản xuất từ hai chủng Nakayama và Beijing-1 đềuđạt được 94% sau 3 mũi tiêm. Các nghiên
cứu này cũng chỉ ra trí nhớ miễn dịch dịch thể và miễn dịch đặc hiệu trung gian tế bào đạt được ít nhất 3 năm sau mũi tiêm thứ 3. Nghiên cứu về kháng thể trung hòa cho thấy các vắc xin VNNB sản xuất từ các chủng khác nhau đều có khả năng trung hịa với tất cả các genotype (5 genotypes) khác nhau của vi rút viêm não Nhật bản. Điều này chứng tỏ vi rút VNNB chỉ tồn tại duy nhất 1 serotype. Đây cũnglà một lợi thế cho sản xuất vắc xin VNNB. Các nghiên cứu của nhiều tác giả cũng cho thấy chủng Beijing-1 tạo kháng thể trung hòa cao hơn chủng Nakayama và các chủng khác [6].
Wills và cs cũng có kết quả tương tự khi dùng chủng SA14-14-2, Nakayama và Beijing-1. Cả 3 chủng đều tạo miễn dịch bảo vệ trên người kháng lại các chủng vi rút VNNB hoang dại. Một số nghiên cứu gần đây chứng minh rằng, gây miễn dịch với vắc xin sản xuất từ chủng Beijing-1 có đáp ứng kháng thể 100% với cả 2 chủng Nakayama và chủng Beijing-1.
Nghiên cứu của Ku và cs (1994) đã kết luận vắc xin sản xuất từ chủng Beijing- 1 có đáp ứng kháng thể cao và miễn dịch chéo rộng với các chủng VNNB khác như chủng JaGar-01 và E-50, hiệu giá kháng thể cao hơn khi so sánh với vắc xin sản xuất từ chủng Nakayama.
Từ các kết quả nghiên cứu thu được trên, Bộ y tế và Bộ ngoại giao Nhật Bản chấp nhận: Chủng Beijing-1 tạo kháng thể trung hòa cao và phản ứng chéo rộng với tất cả các chủng VNNB ở các vùng khác nhau nên lựa chọn chủng Beijing-1 thay chủng Nakayama để sản xuất vắc xin VNNB từ năm 1989.
Ở châu Á chủng Nakayama và Beijing-1 được chọn để sản xuất vắc xin vì khả năng nhân lên rất nhạy trên não chuột và có phản ứng chéo với các chủng khác trên chuột. Kết quả cho thấy chủng Beijing-1 có hiệu giá cao hơn và phản ứng chéo rộng với các chủng VNNB lưu hành ở các vùng khác nhau so với chủng Nakayama[16, 47, 48, 49, 50, 51].Châu Á là vùng dịch tễ lưu hành của bệnh VNNB nên việc giám sát dịch tễ học bệnh viêm não ngày càng phát triển ở Châu Á và nghiên cứu về miễn dịch chéo giữa các chủng VNNB là rất cần thiết.
Với các đặc điểm nổi trội như trên, hiện nay nhiều nhà sản xuất chọn chủng Beijing-1 để sản xuất vắc xin VNNBtrong đó có Việt nam vì các chủng VNNB lưu hành
ở Việt Nam có cùng genotype III với các chủng đang dùng để sản xuất vắc xin như Beijing-1, Nakayama, SA14-14-2, Beijing-3,....
Hình 1.3. Một số vắc xin VNNB sản xuất từ chủng Beijing-1
1.3.3. Chủng SA14-14-2
Chủng vi rút VNNB nguyên thủy SA là chủng độc lực được phân lập từ muỗi năm 1954.Từ 1959-1981, chủng này đã được Trung Quốc nghiên cứu phát triển thành chủng vi rút sống giảm độc lực. Ban đầu chủng nguyên thủy được cấy truyền 110 lần trên trứng gà có phơi và 100 lần trên tế bào thận chuột Hamster. Sau đó tiếp tục được chọn lọc bằng phương pháp tạo đám hoại tử để loại trừyếu tố gây độc thần kinh để tạo chủng giảm độc lực đầu tiên có ký hiệu 12.1.7 [52].Từ chủng 12.1.7, năm 1973, Yu và cs tiếp tục làm giảm độc lực bằng tia cực tím được chủng 12.8. Năm 1974, Chen và Wang chọn lọc chủng vi rút thuần khiết về di truyền bằng kỹ thuật tạo đám hoại tử để có được 1 chủng giảm độc lực đầu tiên dùng sản xuất vắc xin cho thử nghiệm lâm sàng trên 8000 trẻ em sống ở vùng khơng có dịch lưu hành. Kết quả cho thấy 50% trẻ có đáp ứng kháng thể. Năm 1984, chủng 12.8 được Yu và cs tiếp tục tiêm chuyền bằng đường tiêm dưới da cho chuột sơ sinh và đã đạt được 1 chủng giảm độc lực cao đó là chủng 12.4. Sau đó tác giả tiếp tục chọn lọcthuần khiết để cuối cùng có được một chủng nhân lên mạnh mẽ hơn và tính miễn dịch cao hơn trên tế bào so với chủng ban đầu [52], [53].
Việc sản xuất vắc xin vi rút VNNB sống giảm độc lực nuôi cấy trên tế bào đầu tiên được phát triển và được cấp phép ở Trung Quốc năm 1988. Vắc xin này dựa trên chủng JEV SA14 giảm độc lực có tên là SA14-14-2 và sản xuất trên dòng tế bào thận chuột Hamster tiên phát (PHK) [53].
Vắc xin thế hệ thứ hai này có tính miễn dịch cao do hiệu quả bảo vệ cao sau một liều (85% - 99%) và hiệu quả bảo vệ hoàn chỉnh sau 2 liều (98%). Sự có mặt của các kháng thể trung hoà sau 4 năm của liều đơn được quan sát thấy trong gần 90% trường hợp. Vắc xin đã được chứng minh là an tồn (sốt thống qua 5-10%; phát ban hoặc khó chịu là 1-3% và khơng phát hiện trường hợp quá mẫn trong tổng số 1 triệu trẻ sau tiêm vắc xin). Vắc xin đã được cấp phép ở nhiều nước châu Á bao gồm Ấn Độ, Nepal,Thái