CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
2.5. Phương pháp nghiên cứu (chi tiết xem phụ lục 5)
2.5.6. Thử nghiệm công hiệucủa vắcxin
Thử nghiệm công hiệu vắc xin Viêm não nhật bản bất hoạt được xác định dựa trên việc xác định hiệu giá kháng thể trung hòa sau tiêm miễn dịch trên chuột và thử thách trên tế bào Vero hoặc BHK-21 hoặc dòng tế bào phù hợp khác.
Các bước chính của quy trình thử nghiệm như sau:
Pha vắc xin chuẩn và vắc xin thử trong dung dịch PBS 0,02% gelatin để có độ pha 1/32.Mỗi mẫu vắc xin được tiêm phúc mạc cho một nhóm chuột nhắt trắng gồm 16 con, mỗi con 0,5 ml bằng bơm tiêm 1ml vô khuẩn với 2 mũi, mỗi mũi cách nhau 7 ngày.
Sau khi tiêm mũi thứ 2 được 7 ngày, toàn bộ chuột thử nghiệm được lấy máu tim và tách lấy huyết thanh riêng từng chuột.Huyết thanh nhóm chuột tiêm vắc xin mẫu chuẩn được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm mỗi nhóm 8 ống, sau đó chúng được hộn chung vào 1 ống và ký hiệu RA và RB.
Huyết thanh nhóm chuộttiêm vắc xin thử nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm mỗi nhóm 8 ống sau đó hộn chung vào ống ký hiệu VA và VB.
Tất cả các huyết thanh được bất hoạt 56oC /30 phút.
Huyết thanh chuẩn và huyết thanh thử được pha lỗng trong mơi trường MEM 2% FBS để có 3 độ pha là 1/80, 1/160 và 1/320.
Pha huyết thanh chứng dương lấy độ pha loãng 1/80 và 1/160. Pha huyết thanh chứng âm lấy độ pha loãng 1/10.
Pha loãng huyết thanh chứng âm 1/10:0,5 ml huyết thanh + 4,5 ml MEM 2%FBS.
Chủng thử thách (CVS) của vi rút Viêm não Nhật Bản cần đạt hiệu giá 100- 200PFU/ 200l.
Lấy 1 ml của mỗi độ pha huyết thanh được chuẩn bị trộn với 1 ml chủng CVS; 2 ml chủng CVS trộn với 2 ml MEM 2% FBS.
Hỗn hợp huyết thanh và vi rút được gây nhiễm trên tế bào Vero hoặc BHK-21 để xác định số đám hoại tử tế bào tương ứng với mỗi mẫu huyết thanh thử nghiệm. Kết quả cơng hiệu của vắc xin được tính như sau:
Tỉ lệ giảm đám hoại tử được tính theo cơng thức:
100 1 ) ( CV S Y
S: số plaque trung bình của mỗi nồng độ huyết thanh pha. CV số plaque trung bình của CV/giếng.
Hiệu giá kháng thể trung hồ được tính theo cơng thức sau:
x Z Y log10 762 , 47 50
Z: logarit của hiệu giá kháng thể trung hoà giảm 50% đám hoại tử Y: tỉ lệ giảm đám hoại tử của thử nghiệm.
x: số nghịch đảo của độ pha loãng.
2.5.7. An tồn chung
Tính an tồn chung được đánh giá cho vắc xin thành phẩm để xác định các thành phần độc hại có thể tồn tại trong sản phẩm. Trong nghiên cứu này tính an tồn chung vắc xin Viêm não Nhật Bản được thực hiện trên 10 lô vắc xin thành phẩm.
Phương pháp thử được thực hiện theo hướng dẫn của DĐVN V, 2017, PL 15.11:“xác định tính an tồn chung cho các vắc xin, sinh phẩm sử dụng cho người”. Thử nghiệm sử dụng 2 loại động vật thí nghiệm là chuột nhắt và chuột lang. Số lượng chuột được qui định cho một mẫu thử là 2 chuột lang và 5 chuột nhắt. Đường tiêm phúc mạc và liều tiêm tương đương với 1 liều tiêm cho người nhưng không quá 1 ml đối với chuột nhắt và 5 ml đối với chuột lang. Thời gian theo dõi 7 ngày.
Thử nghiệm đạt yêu cầu khi tất cả chuột đều sống sót, khỏe mạnh và lên cân sau 7tiêm.
2.5.8. An toàn đặc hiệu
Thử nghiệm an toàn đặc hiệu được thực hiện trên chuột nhắt trắng nhằm xác định độc tính đặc hiệu liên quan đến vi rút VNNB được sử dụng để sản xuất vắc xin. Nếu vi rút chưa được bất hoạt triệt để trong qui trình sản xuất, động vật tiêm vắc xin có thể xuất hiện các dấu hiệu bệnh lý về thần kinh, não (liệt, mù, chết).
Vắc xin Viêm não Nhật Bản JECEVAX được thử nghiệm an toàn đặc hiệu bằng cách tiêm 0,03 ml vắc xin vào não chuột. Số lượng chuột thí nghiệm cho là 10 chuột/loạt vắc xin thử nghiệm. Chuột sau tiêm vắc xin được theo dõi tăng trưởng cân nặng và các dấu hiệu bệnh lý bất thường trong 14 ngày.
Sau tiêm 14 ngày, chuột thí nghiệm khỏe mạnh, tăng cân và khơng có biểu hiện bệnh lý về thần kinh, não (liệt, mù, chết) thì lơ vắc xin thử nghiệm đạt yêu cầu về tiêu chí an tồn đặc hiệu.
2.5.9. Chất gây sốt
Qui trình thử nghiệm được thực hiện trên thỏ theo hướng dẫn của DĐVN V, 2017, PL 15.12 thử chất gây sốt cho các vắc xin, sinh phẩm sử dụng cho người (chi tiết xem phụ lục 4 đính kèm).
Thử nghiệm chất gây sốt được thực hiện trên thỏ, là phương pháp sinh học dùng để đánh giá tính chất gây sốt của vắc xin, sinh phẩm dựa trên sự tăng thân nhiệt của thỏ trước và sau khi tiêm vắc xin vào tĩnh mạch tai. Nếu sau 3h tiêm vắc xin hoặc
sinh phẩm khơng có cá thể thỏ tăng nhiệt độ >0,60C và tổng số nhiệt độ chênh của 3 thỏ cộng dồn ≤ 1,30C thì mẫu thử đạt yêu cầu về tiêu chuẩn chất gây sốt.
2.5.10. Hàm lượng Thimerosal
Hàm lượng Thiomersal trong vắc xin được xác định dựa trên phản ứng tạo màu của thủy ngân tự do với Dithizone, hợp chất này có độ hấp phụ cực đại tại bước sóng 620 nm.Thử nghiệm được thực hiện theo Dược điển Việt nam V, 2017, phụ lục 15.29.
2.5.11. Hàm lượng Formaldehyde
Formaldehyde là chất dùng để bất hoạt, sử dụng trong điều chế vắc xin.Hàm lượng Formaldehyde trong mẫu được xác định bằng cách so màu của hợp chất được tạo thành do phản ứng của Formaldehyde tự do với thuốc thử Acetylacetone. Hợp chất này có màu vàng chanh và có độ hấp phụ cực đại ở bước sóng 415 nm.Thử nghiệm được thực hiện theo Dược điển Việt nam V, 2017, phụ lục 15.25.
2.5.12. Hàm lượng DNA tồn dư
Vắc xin Viêm não Nhật bản JECEVAX là vắc xin bất hoạt trên tế bào Vero. Do vậy, kiểm định tồn dư DNA của tế bào Vero trên vắc xin là cần thiết nhằm đảo bảo tính tinh sạch an tồn của vắc xin.
Quy trình xét nghiệm tồn dư DNA của tế bào Vero trong vắc xin được thực hiện bằng phương pháp lai DNA-DIG với DNA mẫu sử dụng màng nylon.
Các bước tiến hành như sau:
Xây dựng thang chuẩn DNA: Mẫu DNA chuẩn được pha trong dung dịch TE pH 8 để có 8 điểm chuẩn với lượng DNA thích hợp để đưa lên màng là: 1000, 500, 250, 100, 50, 10, 5 và 1 pg/điểm.
Tách chiết DNA từ mẫu vắc xin: DNA được tách chiết từ mẫu vắc xin cần kiểm tra Qiagen QIAamp DNA Mini Kit. Xử lý mẫu.
Nhỏ mẫu DNA lên màng:
Biến tính DNA chuẩn và DNA mẫu ở nhiệt độ 950C trong vịng 5 phút, sau đó ủ ngay vào đá 10 phút.
Nhỏ mẫu DNA kiểm tra và các mẫu DNA chuẩn lên màng nylon vào các điểm đã được đánh dấu trên màng.
Các điểm đối chứng âm tính chỉ nhỏ dung dịch TE pH 8.
Cho màng vào ống lai và bổ sung 10 ml dung dịch tiền lai (5x Denhardt's reagent, 50% (v/v) formamide, 0.5% (w/v) SDS, 100 μg/ml salmon sperm DNA, 6x SSC). Ủ ở 42oC trong vòng 5 phút. Loại bỏ, dung dịch tiền lai rồi tiếp tục bổ sung 10 ml dung dịch tiền lai mới.
Ủ ở 42oC trong vòng 30 phút.
Thay dung dịch tiền lai bằng 3,5 - 4 ml dung dịch lai (dung dịch tiền lai chứa probe gắn DIG).
Ủ ở 42oC qua đêm. Rửa màng sau lai Phát hiện DNA:
Blocking màng trong 100 ml dung dịch blocking (10% Genius Blocking Reagent in 0.1 M maleic acid and 0.15 M NaCl), lắc nhẹ trong 30 phút.
Pha loãng anti-digoxigenin-AP trong dung dịch blocking tỉ lệ 1:10000 (75mU/ml): cho 100 µl anti-digoxigenin-AP trong 100 ml dung dịch blocking, lắc nhẹ trong 30 phút.
Rửa màng 2 lần với 100 ml dung dịch rửa, mỗi lần lắc nhẹ trong 15 phút. Rửa màng với 100 ml dung dịch rửa, lắc nhẹ trong 5 phút. Loại bỏ hoàn toàn dung dịch sau khi rửa.
Nhỏ 10 ml dung dịch CSDP ready-to-use lên màng, để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ủ 37oC, 10 phút.
Loại bỏ hoàn toàn dung dịch. Bọc nilon rồi ép phim, thời gian khoảng 15-25 phút. Rửa phim
Đánh giá kết quả dựa vào độ phát quang của mẫu thử so với mẫu DNA chuẩn để tính hàm lượng DNA tồn dư trong các mẫu.
2.5.13. Hàm lượng protein tổng số
Protein đóng vai trị là kháng ngun trong vắc xin và là các globulin miễn dịch trong các sinh phẩm. Protein trong vắc xin và sinh phẩm được xác định bằng phương pháp Lowry. Nguyên lý cơ bản của phương pháp là Protein sau khi được tách ra khỏi mẫu bằng cách tạo tủa với TCA liên kết với đồng trong dung dịch đồng alkaline tạo phức đồng – protein. Hợp chất này cho phản ứng màu với thuốc thử Folin và có độ hấp phụ cực đại ở bước sóng 750 nm.
Thử nghiệm được thực hiện theo Dược điển Việt nam V, 2017, phụ lục 15.34.
2.5.14. pH
pH đóng vai trị quan trọng trong các sinh phẩm y tế nói chung, trong vắc xin nói riêng.
Quy trình thực hiện đo pH của Vắc xin Viêm não Nhật Bản JECEVAX được thực hiện theo Dược điển Việt nam V, 2017, phụ lục 15.33.
Độ pH của mẫu vắc xin thử nghiệm được tính bằng giá trị trung bình của hai lần đo.
Thử nghiệm có giá trị khi dung dịch pH chuẩn nằm trong khoảng ± 0,01 so với giá trị của dung dịch pH chuẩn 4,01 và 7,00; và trong khoảng ± 0,02 so với giá trị của dung dịch pH chuẩn 10,01.
2.5.15. Cảm quan
Kiểm tra cảm quan vắc xin có thể quan sát được bằng mắt thường. Bao gồm kiểm tra nhãn mác, sự nguyên vẹn của bao bì, trạng thái sản phẩm, màu sắc cũng như độ trong đục và thời gian hoàn nguyên (đối với các sản phẩm đơng khơ).
Thể tích đóng ống
Thể tích đóng ống được kiểm tra bằng phương pháp đo tỷ trọng. Cụ thể: Lắc đều các lọ vắc xin (tối thiểu 3 lọ), dùng bơm tiêm sạch, hút hết vắc xin trong lọ. Bơm hết vắc xin đã hút được vào cốc sạch.
Trộn vắc xin của mỗi lọ sau khi cân được lại, đo tỷ trọng. Khối lượng vắc xin trong từng lọ Thể tích đóng lọ =
Tỷ trọng vắc xin
Kiểm tra Mycoplasma
Mycoplasma là một trong các tác nhân có nguy cơ tạp nhiễm trong q trình
sản xuất chủng. Trong nghiên cứu này kiểm tra Mycoplasma được thực hiện để kiểm tra chất lượng chủng Beijing-1 sau sản xuất.
Phương pháp sử dụng là nuôi cấy trực tiếp: Cấy trực tiếp mẫu vào môi trường thạch PPLO (pleuropneumonia-like organism agar, là môi trường chuyên dụng cho nuôi cấy và phát hiện Mycoplasma), ủ ở 370C/21 ngày.
Quy trình thực hiện cụ thể: theo hướng dẫn của DĐVN V, 2017, PL 15.47: “Kiểm tra Mycoplasma trong vắc xin/sinh phẩm”.
2.6. Xử lý và phân tích số liệu
Kết quả thử nghiệm của chủng và vắc xin được ghi chép theo các biểu mẫu tiêu chuẩn của VABIOTECH và NICVB. Số liệu thí nghiệm vắc xin được ghi chép, nhập và xử lý bằng phần mềm Excel.
Các phân tích mơ tả được sử dụng để mô tả các giá trị trung bình về trọng lượng và phần trăm tăng trọng lượng của chuột lang, chuột nhắt thí nghiệm; mức tăng nhiệt độ của thỏ thí nghiệm; cơng hiệu, pH, hàm lượng protein tổng số của các loạt vắc xin thử nghiệm.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu
3.1.1. Tính ổn định về hiệu giá và di truyền của chủng Beijing-1
3.1.1.1. Thử nghiệm nhận dạng trên ngân hàng chủng gốc và chủng sản xuất
Bảng 3.1. Kết quả nhận dạng của chủng gốc và chủng sản xuất bằng phương pháp
ELISA
Độ pha lỗng
Kết quả OD trung bình Blank/chứng âm Mẫu chuẩn
BR209 BV-MSV-0210 BV-WSV-0310 10 0,008 0,65 1,62 1,64 40 0,007 0,205 0,961 1,02 160 0,007 0,073 0,52 0,44 640 0,008 0,042 0,14 0,18 Kết quả nhận dạng chủng gốc (BV-MSV-0210) và chủng sản xuất (BV-WSV- 0310) bằng phương pháp ELISA cho thấy, ở nồng độ pha loãng 640 lần, OD của chủng gốc cao hơn khoảng 17,5 lần so với mẫu Blank/chứng âm và chủng sản xuất cao hơn khoảng 22,5 lần so với mẫu Blank/chứng âm. Kết quả này chứng tỏ rằng chủng gốc và chủng sản xuất có hàm lượng kháng nguyên rất cao. Tại độ pha loãng 10 lần, chủng gốc và chủng sản xuất đều có hàm lượng kháng nguyên cao hơn mẫu chuẩn gấp khoảng 2,5 lần (bảng 3.1).
Kết quả giải trình tự gen của vi rút của chủng gốc (BV-MSV-0210) và chủng sản xuất (BV-WSV-0310) cho thấy trình tự nucleotide và trình tự axit amin vùng gen sinh tổng hợp kháng nguyên E của 2 chủng này có sự tương đồng 100% và so với chủng chuẩn tham chiếu Reference JEV Beijing-Kanonji cũng tương đồng 100% (Hình 3.1).
Hình 3. 1. Kết quả giải trình tự gen và xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự
nucleotide (A) và axít amin (B) của chủng gốc và chủng sản xuất với chủng Beijing chuẩn
A
3.1.1.2. Kết quả kiểm tra hiệu giá vi rút chủng gốc và chủng sản xuất
Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra LD50 trên não chuột Swiss của chủng gốc BV-MSV-
0210 Độ pha Số chuột thí nghiệm Số chuột sống Số chuột chết % chuột chết Hiệu giá chủng (LD50) 10-6 10 0 10 100 4,79.107 10-7 10 2 8 85,7 10-8 10 6 4 33,33
Kết quả kiểm tra hiệu giá vi rút trên não chuột của chủng gốc (BV-MSV- 0210), ở độ pha 10-6 chuột chết 100%, độ pha 10-7 tỷ lệ chết 85,7% (>50%), độ pha 10-8 tỷ lệ chết 33,33 %(<50%). LD50 của chủng xác định là 4,79.107. Hiệu giá của chủng gốc được xác định là > 107/ml, đạt tiêu chuẩn dự kiến là ≥ 107/ml (bảng 3.2).
Bảng 3. 3. Kết quả kiểm tra LD50trên não chuột Swiss của chủng sản xuất BV-
WSV-0310 Độ pha Số chuột thí nghiệm Số chuột sống Số chuột chết % chuột chết Hiệu giá chủng (LD50) 10-6 10 0 10 100 2,24.107 10-7 10 3 7 72,7 10-8 10 9 1 7,7
Kết quả kiểm tra hiệu giá vi rút trên não chuột của chủng sản xuất(BV-WSV- 0310) cho thấy, ở độ pha 10-6 chuột chết 100%, độ pha 10-7 tỷ lệ chết 72,7% (>50%), độ pha 10-8 tỷ lệ chết 7,7 %(<50%). LD50 của chủng xác định là 2,24.107. Hiệu giá của chủng sản xuất được xác định là > 107/ml, đạt tiêu chuẩn dự kiến là ≥ 107/ml (bảng 3.3).
Hiệu giá chủng vi rút sản xuất vắc xin Viêm não Nhật Bản BV-WSV-0310 được thực hiện bằng phương pháp tạo đám hoại tử PFU/ml trên tế bào sau 5 ngày gây nhiễm được mơ tả tại hình 3.2.
Hình 3.2. Hình ảnh plaque (đám hoại tử- đốm trắng) của chủng sản xuất BV-WSV-
0310 ở các độ pha 10-6; 10-7; 10-8
Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra hiệu giá chủng gốc BV-MSV-0210bằng thử nghiệm tạo đám
hoại tử (PFU) trên tế bào BHK21
Độ pha loãng
Số plaque Hiệu giá (PFU/ml)
Hiệu giá trung bình (PFU/ml) Số plaque Trung bình 10-5 100; 137 118,5 5,92.107 8,72.107 (hay 7,94 log) 10-6 22; 19 20,5 10,25.107 10-7 1; 3 2,0 10,00.107 10-8 0;0 0 0
Bằng phương pháp thử nghiệm trên tế bào, hiệu giá trung bình của chủng gốc BV-MSV-0210 là 8,72x107 PFU/ml (bảng 3.4).
Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra hiệu giá chủng sản xuất BV-WSV-0310 bằng thử nghiệm tạo
đám hoại tử (PFU) trên tế bào BHK21
Độ pha loãng Số plaque Hiệu giá (PFU/ml)
Hiệu giá trung bình (PFU/ml) Số plaque Trung bình 10-5 91;84 87,5 4,37. 107 3,93. 107 (hay 7,59 log) 10-6 6;8 7 3,50.107 10-7 0;0 0 0
Bằng phương pháp thử nghiệm trên tế bào, hiệu giá trung bình của chủng sản xuất BV-WSV-0310 là 3,93x107 PFU/ml (bảng 3.5).
Trước Vabiotech chỉ sử dụng tế bào BHK-21, trong nghiên cứu chúng tôi sử dụng thêm cả tế bào Vero là dòng tế bào sử dụng để sản xuất vắc xin để thẩm định sự phù hợp và cần thiết có thể thay thế tế bào BHK-21 cho tiện sử dụng kiểm định sau này.
10-6 10-7
Thử nghiệm tạo đám hoại tử (PFU) trên tế bào BHK21
Thử nghiệm tạo đám hoại tử (PFU) trên tế bào Vero
Hình 3. 3.Hình ảnh plaque (đám hoại tử- đốm trắng) của chủng sản xuất BV-WSV-
0310 trên dòng tế bào BHK21 và dòng tế bào Vero.
Kết quả hình Plaque ở tế bào BHK21 tạo ra to hơn tế bào Vero nhưng số lượng (kết quả) như nhau và đều dễ đọc bằng mắt thường (hình 3.3).
3.1.1.3. Tính ổn định về di truyền của chủng theo thời gian cất giữ
a. Kết quả khuếch đại gen mã hóa kháng nguyên E của chủng gốc, chủng sản xuất và chủng tham chiếu