Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.4. Tổng quan nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy tế bào là kỹ thuật duy trì và phát triển các tế bào ở ngoài cơ thể sống những vẫn thực hiện đầy đủ các chức năng biến dưỡng và chức năng chuyên biệt của tế bào. Quá trình nuôi cấy tế bào cho phép mỗi tế bào đóng vai như những tế bào độc lập, nó có thể phân chia nhờ quá trình nguyên phân và quần thể tế bào tiếp tục phát triển cho đến khi bị giới hạn bởi bề mặt nuôi cấy hay sự cạn kiệt dinh dưỡng. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được tiến hành lần đầu tiên vào năm 1970 với Harrison. Ngày nay kỹ thuật này đã được ứng dụng rộng rãi trong y học và thú y học để nghiên cứu tác đông của các chất lên tế bào hay nghiên cứu virut để phân lập, giám định, chuẩn độ vi rút, xác định tính chất huyết thanh học, quan sát hình thái siêu cấu trúc của vi rút và đặc biệt là sản xuất vắc xin. Quá trình nuôi cấy thường gồm những tế bào thuộc cùng một loại.
2.4.1. Một số đặc điểm của tế bào động vật
Tính cơ học yếu: tế bào động vật không vách và kích thước tế bào khá lớn (khoảng 10µm) nên tính bền cơ học yếu. Do đó, khi nuôi cấy tế bào động vật rất dễ vỡ do các lực tác động khi thao tác trên tế bào như khuấy trộn để tách tế bào, di chuyển mẫu tế bào.
Tăng trưởng và phân chia chậm: thời gian tăng trưởng gấp đôi của tế bào trung bình là 30 giờ. Trong khi đó thời gian này của vi khuẩn chỉ khoảng 30 phút.
Tính cần giá đỡ: hầu hết tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia. Thông thường, tế bào phát triển tốt khi gắn vào bề mặt rắn. Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt dụng cụ nuôi. Tuy vậy, một số tế bào như tế bào ung thư có thể sinh trưởng và phân chia ở trạng thái lơ lửng không cần giá đỡ (Phúc, 2009).
Tế bào động vật có thể được bảo quản trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -196˚C, ở nhiệt độ này tế bào có thể giữ được khả năng sống không hạn định và sẽ phát triển trở lại trên môi trường nuôi cấy khi hồi phục.
Ngoài ra, tế bào còn có các đặc tính khác như: kém thích nghi với môi trường, nhạy cảm với các ion kim loại và đa số tế bào động vật cần huyết thanh, hormone tăng trưởng để phân chia (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006).
2.4.2. Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào
Môi trường nuôi cấy tế bào phức tạp và giàu dinh dưỡng để tạo điều kiện tốt nhất cho sự phát triển của tế bào. Môi trường có thể được cung cấp dưới dạng dung
dịch để sử dụng ngay hay dưới dạng dung dịch đậm đặc hoặc dạng bột. Dạng dung dịch đậm đặc có thể sử dụng pha loãng với nước cất tiệt trùng, trong khi dạng bột phải được hòa tan trong nước và tiệt trùng bằng cách lọc qua lưới lọc 0,22µm.
Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy:
Carbonhydrate: glucose (5-10mM) cũng được dùng trong hầu hết các công thức để cung cấp nguồn năng lượng cũng như tiền chất cho tổng hợp sinh học, như ribose cần cho tổng hợp acid nucleic. Có thể dùng fructose thay thế cho glucose. Glucose có trong hầu hết môi trường là nguồn ly giải tạo pyruvate vào chu trình acid citric và sinh ra CO2 (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006).
Amino acid (0,1-0,2mM) cũng được dùng như là nguồn tiền chất cho tổng hợp protein. Người ta thường sử dụng glutamine, tuy nhiên, ammoniac được thành lập từ chuyển hóa glutamine có thể ức chế sự sinh trưởng trong một số quá trình nuôi cấy (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006).
Muối cũng được dùng để làm cho môi trường có tính đẳng trương, duy trì sự cân bằng với phần bên trong tế bào.
Bicarbonate (NaHCO3) cũng được dùng để đóng vai trò như hệ thống đệm trong sự kết hợp với 5-10% CO2 được cung cấp bởi tủ ấm. Điều này cho phép môi trường duy trì có pH từ 7,2-7,4.
Vitamin và hormone hiện diện ở nồng độ tương đối thấp và được dùng để kích thích sinh trưởng. Lượng vitamin và hormone thay đổi nhiều giữa các công thức môi trường khác nhau. Điều nay cho thấy nhu cầu vitamin của các dòng tế bào là khác nhau.
Huyết thanh được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào để cải thiện sự sinh trưởng của tế bào, giúp tế bào dễ bám vào bề mặt thủy tinh và phát triển mạnh hơn. Huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum-FBS) thường sử dụng bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Các protein trong huyết thanh như albumin, fibronectin, globulin giúp tế bào bám dính và phát triển (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006).
Kháng sinh thường được cho vào môi trường nuôi cấy trong thời gian ngắn nhằm làm giảm nguy cơ tạp nhiễm. Nồng độ tối ưu của kháng sinh được xác định theo nghiên cứu của người tiến hành nuôi cấy. Kháng sinh thường được dùng dưới dạng kết hợp, có thể sử dụng Penicilin G, Streptomycin và Amphotericin B để ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương, Gram âm và chống nấm (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006).
2.4.3. Điều kiện nuôi cấy tế bào
Hầu hết tế bào trong môi trường nuôi cấy sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 370C và pH=7,4. Nếu ở nhiệt độ thấp hơn một chút so với 370C thì tốc độ sinh trưởng sẽ giảm xuống nhưng tế bào không bị phá hủy. Tuy nhiên nhiệt độ cao hơn, từ 390C- 400C sẽ phá hủy tế bào. Do vậy, việc đảm bảo rằng nhiệt độ không tăng trong tủ cấy là rất quan trọng (Butler, 2004).
2.4.4. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế
Nguyên nhân chính của sự thất bại trong nuôi cấy tế bào là sự tạp nhiễm. Sự tạp nhiễm thường do tiệt trùng dụng cụ không đạt yêu cầu và thường bắt nguồn từ sự tiếp xúc của con người như là bàn tay, hơi thở. Môi trường và thiết bị ngày nay được cung cấp sẵn nhằm hạn chế tới mức tối đa những nguy cơ tạp nhiễm này. Nguy cơ này cũng có thể được giảm bớt hơn nữa bởi sự quan tâm cẩn thận tới từng chi tiết khi tiến hành nuôi cấy.
Nhằm giảm bớt các nguồn tạp nhiễm, cần chú ý rửa tay với xà phòng diệt khuẩn trước và sau quá trình có liên quan đến nuôi cấy tế bào (có thể sử dụng gang tay y tế), hạn chế những con đường tới phòng thí nghiệm khi thí nghiệm đang tiến hành, làm sạch bề mặt làm việc trước và sau mỗi quá trình nuôi cấy, dùng không gian tiệt trùng (tủ cấy tiệt trùng) cho tất cả các thao tác, dùng ống nghiệm nuôi cấy bằng plastic được tiệt trùng và chỉ dùng một lần, sử dụng môi trường và huyết thanh từ nhà cung cấp đáng tin cậy để đảm bảo rằng sự tạp nhiễm không phát sinh từ nguồn này (Butler, 2004).
2.4.5. Sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy
Sự sinh trưởng của tế bào động vật invitro thường trải qua 4 giai đoạn:
- Pha chậm (Lag phase) là giai đoạn khi tế bào được đưa vào môi trường nuôi cấy cho đến khi tế bào bắt đầu phát triển. Thời gian này dài hay ngắn tùy thuộc vào trạng thái biệt hóa của mô được lấy tế bào ( Nguyễn Như Hiên, 2007).
- Pha logarit (Log Phase) hay Pha tiến triển (exponential phase) là giai đoạn tế bào phân chia liên tục, tăng nhanh số lượng tế bào. Trong giai đoạn này, tế bào sinh trưởng và phân cắt với nhịp độ tối đa so với bản tính di truyền của chúng nếu gặp môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Nhịp độ sinh trưởng của chúng là không thay đổi trong suốt giai đoạn này, các tế bào phân đôi một cách đều đặn. Quần thể tế bào trong giai đoạn này có trạng thái hóa học và sinh lý học cơ bản là như nhau, cho nên việc nuôi cấy ở giai đoạn này thường được sử dụng để nghiên
cứu sinh hóa học và sinh lý học tế bào. Sinh trưởng logarit là sinh trưởng đồng đều, tức là các thành phần tế bào được tổng hợp với tốc độ tương đối ổn định. Nếu cân bằng dinh dưỡng hay các điều kiện môi trường thay đổi sẽ dẫn đến sự sinh trưởng không đồng đều. Sự sinh trưởng khi nhịp độ tổng hợp các thành phần của tế bào tương đối biến hóa sẽ biến đổi theo cho đến khi đạt tới một sự cân bằng mới. Phản ứng này rất dễ quan sát thấy khi làm thực nghiệm chuyển tế bào từ một môi trường nghèo dinh dưỡng sang một môi trường giàu hơn. Tế bào trước hết phải tạo nên các ribosome mới có thể nâng cao năng lực tổng hợp protein, sau đó là sự tăng cường tổng hợp protein và DNA. Cuối cùng tất yếu dẫn đến tốc độ phát triển nhanh chóng ( Nguyễn Như Hiên, 2007).
- Pha dừng (Stationary phase): Qua giai đoạn Logarit sự sinh trưởng sẽ dừng lại. Số lượng tế bào cuối cùng quyết định bởi ảnh hưởng chung của điều kiện dinh dưỡng, chủng loại và các nhân tố khác. Trong giai đoạn này, số lượng tế bào sống là không thay đổi, có thể do số lượng tế bào mới sinh ra cân bằng với số lượng tế bào chết đi, hoặc là tế bào ngừng phân cắt mà vẫn giữ nguyên hoạt tính trao đổi chất. Nguyên nhân chủ yếu là sự hạn chế của chất dinh dưỡng. Nếu một chất dinh dưỡng thiết yếu bị thiếu hụt nghiêm trọng thì sự sinh trưởng sẽ chậm lại. Cũng có thể sự sinh trưởng dừng lại khi môi trường có nhiều các sản phẩm trao đổi chất có hại. Sau nữa là, một số chứng cứ cho thấy, khi số lượng tế bào đạt đến một giới hạn nhất định thì sự sinh trưởng có thể bị dừng ( Nguyễn Như Hiên, 2007).
- Giai đoạn tử vong (Death Phase): Việc tiêu hao chất dinh dưỡng và việc tích lũy các chất thải độc hại sẽ làm ảnh hưởng đến môi trường sống của tế bào, làm cho số lượng tế bào sống giảm xuống. Đó là đặc điểm của giai đoạn tử vong. Giống như giai đoạn logarit, sự tử vong của tế bào cũng có tính logarit (tỷ lệ tế bào chết trong mỗi giờ là không đổi). Muốn cho tế bào tiếp tục sinh trưởng cần thực hiện các mẻ cấy chuyền với môi trường mới ( Nguyễn Như Hiên, 2007).
2.5. HỆ THỐNG MICROCARRIER
2.5.1. Lý do lựa chọn phương pháp nuôi cấy trên Microcarrier
Các kỹ thuật nuôi cấy tế bào đã trở nên thiết yếu đối với việc nghiên cứu cấu trúc, chức năng cũng như là việc sản xuất nhiều nguyên liệu sinh học quan trọng như vắc xin, enzyme, hormone, kháng thể, interferon và các axit nucleic. Nuôi cấy Microcarrier đã mở ra những khả năng mới và lần đầu tiên được hiện thực bởi việc nuôi cấy các tế bào bám dính năng suất cao ở quy mô lớn.
Phương pháp nuôi cấy trên Microcarrier có các ưu điểm sau: *) Tạo nhiều cơ hội và ứng dụng mới của nuôi cấy tế bào động vật
Microcarriers cung cấp bề mặt thích hợp cho việc phát triển của tế bào động vật hoặc tăng năng suất tế bào từ các dạng nuôi cấy một lớp. Những ứng dụng bao gồm việc sản xuất một lượng lớn tế bào, vi rút và các sản phẩm tế bào, những nghiên cứu về sự biệt hóa và chức năng của tế bào, nuôi cấy với hệ thống môi trường tự động, nghiên cứu hiển vi, thu hoạch các tế bào đang phân chia, phân lập tế bào, nghiên cứu màng tế bào, dự trữ và vận chuyển của tế bào, các phương pháp liên quan tới sự vận chuyển và nghiên cứu việc hấp thụ các hợp chất có đánh dấu (Nilsson & Kjell, 1998).
*) Tăng khả năng sản xuất
Diện tích bề mặt nuôi cấy lớn so với tỷ lệ thể tích được tạo ra bởi hệ thống Microcarrier (ví dụ: 30 cm2 trong 1ml sử dụng 5mg Cytodex 1) tạo ra năng suất tế bào cao mà không cần tới các thiết bị cồng kềnh và phương pháp phức tạp. Đối với một lượng tế bào nhất định hoặc những sản phẩm từ chúng, nuôi cấy Microcarrier cần ít khoảng không gian hơn so với các loại nuôi cấy một lớp khác (Nilsson & Kjell, 1998).
*) Các tế bào tách biệt với sản phẩm tiết
Công nghệ Microcarrier là một phương pháp cho việc duy trì tế bào, phương pháp này có nghĩa là tỷ lệ pha loãng sẽ độc lập với tỷ lệ sinh trưởng của các tế bào. Thứ hai là, bởi vì có ít các tế bào ở trong dòng thu hoạch, quá trình xử lý đầu cuối sẽ trở nên đơn giản hơn. Người ta sẽ chuyển một phần của bước phân loại thành quá trình lên men (Nilsson & Kjell, 1998).
Hình 2.2. Hình ảnh quá trình tế bào tách biệt với sản phẩm tiết
Các hệ thống Microcarrier cho phép kiểm soát các thông số nuôi cấy một cách hoàn hảo (ví dụ: pH, mức độ khí…). Kỹ thuật Microcarrier cung cấp một phương pháp cho sự sinh trưởng của các tế bào bám dính ở trong một hệ thống có tất cả thuận lợi của việc nuôi cấy dạng huyền phù. Việc kiểm soát và lấy mẫu trong nuôi cấy Microcarrier đơn giản hơn so với bất kỳ kỹ thuật khác trong việc tạo ra một số lượng lớn các tế bào bám dính (Nilsson & Kjell, 1998).
*) Sự bảo vệ chống lại stress vật lý và hóa học
Các Microcarriers dạng macroporous bảo vệ các tế bào kháng lại đầu nhọn của máy khuấy, đặc biệt khi sản xuất ở quy mô lớn. Việc sục khí với các vi bong bóng sử dụng oxy tinh khiết cũng có thể thực hiện được do có sự bảo vệ này. Các tế bào có khả năng chịu đựng với nhiều stress hóa học như là lactate, amoni và oxygen nếu chúng được sinh ra ở vi môi trường xung quanh các lỗ (Nilsson & Kjell, 1998).
*) Những yêu cầu được giảm thiểu cho môi trường nuôi cấy
Khi so sánh với các kỹ thuật nuôi tế bào 1 lớp hoặc nuôi huyền phù khác, việc nuôi cấy Microcarrier có khuấy đã tăng năng suất lên tới 100 lần đối với nhiều tế bào trong một thể tích môi trường nuôi nhất định. Năng suất siêu cao đã được báo cáo đối với một phạm vi rộng của các hệ thống bao gồm các tế bào xơ phôi gà, tế bào thận lợn, tế bào cá, tế bào não chuột Hamster Trung Quốc, tế bào sợi người, tế bào thận khỉ sơ cấp và các tế bào sợi chuột đã biến đổi. Sự yêu cầu tối giản đối với môi trường nuôi cấy đã tạo ra một sự tiết kiệm đáng kể trong chi phí nuôi cấy tế bào, đặc biệt khi chất huyết thanh bổ sung đắt như là huyết thanh bào thai bê. Các Microcarrier dạng lỗ đặc biệt cung cấp một vi môi trường hoàn hảo ở đó các tế bào có thể trao đổi những hornome sinh trưởng tự tiết của chính chúng, bởi vậy cho phép môi trường sử dụng không cần bổ sung protein (Nilsson & Kjell, 1998).
*) Những yêu cầu giảm thiểu về phòng Lab
Nuôi cấy Microcarrier cho phép nuôi cấy một số lượng lớn các tế bào trong một thể tích nhỏ (hơn 1011 tế bào/l), sử dụng rất ít các thiết bị nuôi. Ví dụ, một người kỹ thuật có thể xử lý một sản phẩm vắc xin tương đương với 900 bình roller trên một tuần. Việc nuôi cấy Microcarrier có thể đạt năng suất tế bào ngang bằng với 50 chai roller (chai có diện tích 490 cm2) và 1 tới 1,5 ml của các hạt có lỗ có
thể đạt năng suất ngang bằng một chai roller có diện tích 850 cm2. Các quy trình trên Microcarrier đã được đơn giản hóa, giảm nhân lực lao động cần thiết cho việc sản xuất hàng ngày. Các tế bào tách biệt từ môi trường nuôi cấy đơn giản, khi quá trình khuấy dừng lại các tế bào lắng kết dưới sự ảnh hưởng của trọng lực và dịch trong phía trên có thể được loại bỏ. Không giống với các hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào, không cần thiết phải thêm bước ly tâm (Nilsson & Kjell, 1998).
*) Nguy cơ tạp nhiễm thấp
Trong nuôi cấy tế bào, nguy cơ tạp nhiễm có liên quan tới số lượng các bước thao tác (ví dụ: mở và đóng các thiết bị nuôi) để sản xuất một lượng tế bào hoặc một sản phẩm nhất định. Nuôi cấy Microcarrier giảm thiểu số lượng các bước thao tác. Nguy cơ tạp nhiễm được giảm thiểu rất nhiều khi sản xuất một lượng lớn tế bào ở trong một đợt nuôi cấy Microcarrier so với vài trăm bình roller (Nilsson & Kjell, 1998).
2.5.2. Sự phát triển của các hạt chất mang
Ý tưởng nuôi cấy tế bào động vật trên Microcarrier được hình thành đầu tiên bởi Van Wezel. Trong các thí nghiệm đầu tiên, Van Wezel đã sử dụng môi trường