Phần 3 Nội dung vật liệu phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào
3.5.1.1. Phương pháp xác định tốc độ khuấy và lưu lượng khí
Phương pháp xác định tốc độ khuấy
Để lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp để nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier, chúng tôi thực hiện khuấy với 3 tốc độ khuấy khác nhau 30, 60, 90rpm. Bố trí cụ thể được trình bày trong bảng dưới đây:
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp
Tốc độ khuấy 30
60 90
Phương pháp xác định DO
Để lựa chọn giá trị DO thích hợp cho nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier, chúng tôi thực hiện với giá trị DO khác nhau 30%, 40%, 50%, 60%. Bố trí cụ thể được trình bày trong bảng dưới đây:
Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm xác định tốc độ khuấy thích hợpGiá trị DO Giá trị DO (%) 30 40 50 sau 48 giờ. 60
Phương pháp xác định lưu lượng khí
Theo thiết kế của hệ thống, lưu lượng khí cấp vào trong khoảng từ 0,2 - 1 lít/phút. Để xác định lưu lượng khí cấp vào thích hợp, chúng tôi sử dụng khí trộn của 4 loại khí N2, O2, CO2, không khí với các lưu lượng khí khác nhau: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 lít/phút cấp vào trong môi trường trên hệ thống Microcarrier, tốc độ khuấy 60, DO =50%. Bố trí thí nghiệm được trình bày bảng dưới đây:
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm xác định lưu lượng khí trong bình nuôiLưu lượng khí cấp Lưu lượng khí cấp vào (lít/phút) 0,2 0,4 0,6
3.5.1.2. Phương pháp xác định mật độ tế bào đầu vào
Mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu đối với nuôi cấy Microcarrier trong khoảng 0,5 – 2x105 tế bào/ml. Để xác định mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu tối ưu trong nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier, chúng tôi tiến hành nuôi tế bào PK 15 trong 10 lít môi trường nuôi cấy với mật độ tế bào bổ sung ban đầu trong môi trường là 0,5x105 tế bào/ml; 1x105 tế bào/ml; 1,5x105 tế bào/ml; 2x105 tế bào/ml. Bố trí thí nghiệm được trình bày trong bảng dưới đây:
Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm xác định lượng tế bào tối ưu cho nuôi cấy
Mật độ tế bào
0,5x105 tế bào/ml 1x105 tế bào/ml 1,5x105 tế bào/ml 2x105 tế bào/ml
3.5.1.3. Phương pháp xác định môi trường nuôi và pH môi trường nuôi
Để xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier, chúng tôi tiến hành nuôi tế bào trên hệ thống với các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau như: Lactanbumin Hydrolysate (LH), Medium 199 (M199), Minimum Essential Medium (MEM), Dulbecco's Modified Eagle Medium
Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm xác định môi trường nuôi cấyMôi trường Môi trường nuôi cấy LH M199 MEM DMEM
Khi có kết quả xác định được loại môi trường nuôi cấy chúng tôi tiến hành thí nghiệm xác định pH môi trường nuôi cấy sử dụng để nuôi cấy tế bào PK 15 như dưới bảng 3.6.
Bảng 3.6. Bố trí thí nghiệm xác định pH tối ưu cho nuôi cấy
pH của môi trường nuôi cấy
7,0±0,1 7,2±0,1 7,4±0,1
3.5.1.4. Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của tế bào PK 15
Để xác định thời gian nuôi cấy thích hợp tế bào PK 15 trên Microcarrier, chúng tôi tiến hành xác định đường cong sinh trưởng của tế bào PK 15 khi nuôi trên hệ thống Microcarrier quy mô 10 lít với các điều kiện đã được tối ưu ở các công việc trước đó: số tế bào đầu vào: 1,5 x 109 tế bào; pH = 7,0±0,1; môi trường nuôi MEM 5% FBS+KS; tốc độ khuấy = 50, DO= 50%, Lưu lượng khí =0,6 l/phút. Trên hệ thống nuôi cấy với thể tích 10 lít, sau 24, 48, 72, 96, 120, 144h nuôi cấy chúng tôi tiến hành lấy mẫu tách và đếm số lượng tế bào, lặp lại thí nghiệm 03 lần để xây dựng đường cong sinh trưởng trung bình của tế bào PK 15. Từ đường cong sinh trưởng của tế bào PK 15 xác định được thời gian nuôi cấy tế bào thích hợp trước khi gây nhiễm vi rút DTL.
chóng trong bể ổn nhiệt 370C. Sau rã đông chuyển ống vào Laminar air flow (Laf) vô trùng, chuyển hỗn dịch tế bào vào ống ly tâm có chứa môi trường nuôi cấy đã được làm ấm của tế bào tương ứng. Ly tâm hỗn dịch tế bào trong khoảng 1500v/10 phút.
Sau ly tâm loại bỏ phần dịch nổi, giữ phần tế bào lắng cặn ở dưới. Hoàn nguyên bằng môi trường nuôi tế bào. Trộn đều bằng cách dùng pipet hút nhả.
Chuyển toàn bộ dung dịch tế bào này vào chai nuôi tế bào Tfask có môi trường nuôi dưỡng bổ sung huyết thanh và kháng sinh.
Ủ chai nuôi cấy ở tủ ấm 370C, 5% CO2.
Qua 1 ngày, loại bỏ môi trường nuôi dưỡng cũ để loại bỏ DMSO, rửa lớp tế bào bằng dung dịch PBS rồi cho môi trường nuôi dưỡng mới bổ sung huyết thanh.
Ủ chai nuôi tế bào ở tủ ấm 370C, 5% CO2 để tế bào phát triển. Hằng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào trên kính hiển vi quang học.
*) Tách tế bào
Rửa chai tế bào bằng PBS(-): 1 – 2 lần. Cho TE 0,05%, láng chai Ủ 370C, 5 – 15 phút, cho tới khi tế bào co tròn, bắt đầu bong khỏi đáy chai, vỗ nhẹ chai nuôi, trung hòa bằng môi trường 5% huyết thanh. Đếm số tế bào trên buồng đếm hồng cầu, định lượng tế bào. Tính toán và chia tế bào ra các chai nuôi ở tủ ấm 370C.
Hàng ngày quan sát khả năng phát triển của tế trong các chai tế bào trên kính hiển vi quang học.
Nhân số lượng tế bào trên các chai nuôi cấy.
Để đủ số lượng tế bào PK 15 nuôi trên hệ thống Microcarrier với dung tích
10lít, 30g hạt Cytodex-1, tế bào PK 15 cần phải được nhân theo từng cấp độ với quy mô lớn dần. Quy trình nhân số lượng tế bào được mô tả trong hình dưới đây:
*) Phương pháp đếm tế bào
Chuẩn bị buồng đếm
Dùng vải gạc sạch, tẩm cồn lau sạch buồng đếm và phiến kính đậy. Để buồng đếm và phiến kính đậy khô hoàn toàn (có thể hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn).
Đặt buồng đếm trên mặt phẳng ngang rồi đặt phiến kính đậy vào vị trí buồng đếm. Chú ý không để phiến kính đậy bị lệch, kênh.
Hình 3.3. Buồng đếm tế bào
Trên buồng đếm tế bào có 2 vùng đếm, 1 vùng ở trên và 1 vùng ở dưới. Mỗi vùng có 4 ô đếm.
Buồng đếm tế bào
Trong mỗi ô đếm, thứ tự đếm được mô tả như trên hình vẽ.
Tiến hành đếm số lượng tế bào sau đó tiến hành tính toán theo công thức
Công thức:
C Hệ số pha loãng tế bào
A Số tế bào đếm lần 1 B Số tế bào đếm lần 2
16 Số ô đếm của 2 buồng (8 ô × 2 buồng đếm) 104 Nghịch đảo thể tích dịch trong 1 ô đếm
V Thể tích bình nuôi cấy tế bào