Khả năng lắng hạt Tạo bọt môi trường
Độ bám tế bào (%)
Kết quả điều chỉnh tốc độ khuấy cho thấy: Điều chỉnh tốc độ khuấy 30 vòng/phút và 60 vòng/phút môi trường nuôi không tạo bọt tuy nhiên ở tốc độ khuấy 30 vòng/phút các hạt Cytodex bị lắng xuống đáy bình nhanh còn ở tốc độ khuấy 60 vòng/phút không bị lắng các hạt Cytodex xuống đáy bình.Ở tốc độ khuấy 90 vòng/phút các hạt Cytodex không bị lắng nhưng môi trường nuôi tạo bọt.
(1) (2)
Hình 4.1. (1) Bình nuôi có bọt, (2) bình nuôi cấy không có bọt Độ bám tế bào ở từng tốc độ khuấy khác nhau cũng khác nhau. bọt Độ bám tế bào ở từng tốc độ khuấy khác nhau cũng khác nhau.
• Ở tốc độ khuấy 30 vòng/phút sau 24 giờ nuôi tế bào bám và phát triển khoảng 10- 20%, đến 72 giờ nuôi tế bào bám khoảng 50-60% hạt Cytodex và sau 96 giờ nuôi tế bào PK 15 vẫn chưa bám kín hạt Cytodex khoảng 80-90%, phía đáy bình nuôi các hạt Cytodex lắng xuống có hiện tượng tế bào phát triển không đều.
• Ở tốc độ khuấy 60 vòng/phút tế bào bám và phát triển sau 24 giờ nuôi khoảng 20-30%, sau 72-96 giờ tế bào phát triển và bám kín hạt Cytodex 90-100%.
• Tốc độ khuấy 90 vòng/phút do tốc độ khuấy mạnh nên môi trường tạo bọt, tế bào bám và phát triển sau 24 giờ nuôi, sau 96 giờ nuôi tế bào bám kín hạt Cytodex, tuy nhiên mức độ bám tế bào trên hạt Cytodex không đều, hạt dày, hạt thưa tế bào.
Như vậy, tốc độ khuấy 60 vòng/phút không tạo bọt môi trường nuôi, không làm lắng hạt Cytodex xuống đáy bình, tế bào PK 15 phát triển và bám kín hạt Cytodex sau 72-96 giờ nuôi. Vậy nên chọn tốc độ khuấy 60 vòng/phút làm tốc độ khuấy cho các thí nghiệm tiếp theo của nuôi tế bào PK 15 trên hệ thốngMicrocarrier. Kết quả tốc độ phù hợp với nuôi cấy tế bào theo nghiên cứu của GE healthcare (Freshney, 2015).
4.1.1.2. Xác định giá trị DO thích hợp để nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
DO (Dissolved Oxygen) là nồng độ Oxy hòa tan trong nước, hàm lượng O2
trong nước hay môi trường nuôi rất cần thiết cho sự hô hấp của tế bào. Nồng độ oxy trong môi trường thấp sẽ gây ức chế và giảm sự phát triển của tế bào.
Tiến hành thí nghiệm với 4 mức độ DO: 30%, 40%, 50%, 60%, lượng tế bào đầu vào cho 4 giá trị DO là: 1 x109 tế bào/30 gam Micro carrier/bình nuôi cấy 10 lít/giá trị DO.
Kết quả thí nghiệm trình bày bảng 4.2:
Bảng 4.2. Mức độ bám tế bào PK 15 vào hạt Cytodex ở các giá trị DO khác nhau
Kết quả theo dõi cho thấy mức độ bám và phát triển của tế bào PK 15 khác nhau ở các giá trị DO khác nhau, sau 24 giờ nuôi tế bào bắt đầu bám vào hạt Cytodex. Tuy nhiên, tế bào ở bình có giá trị DO=30-40% phát triển kém hơn (tế bào bám khoảng 10-20%) tế bào ở bình DO=50-60% (tế bào bám khoảng 20- 30%). Sau 72 giờ nuôi, DO=30-40% tế bào bám khoảng 70-80% trên bề mặt hạt Cytodex. Giá trị DO=50% sự nhân lên và phát triển của tế bào tốt hơn, bám gần hết kín hạt Cytodex khoảng 90-95%. Giá trị DO=60% sự nhân lên và phát triển của tế bào chậm hơn, bám 70-80% hạt Cytodex.
Sau 48 giờ nuôi tế bào, tiến hành lấy mẫu, tách tế bào xác định năng suất sinh sản của tế bào ở các giá trị DO khác nhau.
Kết quả theo dõi đánh giá khả năng phát triển của tế bào sau 48h như bảng 4.3:
Bảng 4.3. Kết quả theo dõi năng suất sinh sản của tế bào sau 48h nuôi cấy
Lô 01 Giá trị DO (%) SLTB 30 40 50 60
Từ kết quả bảng 4.3 chúng tôi tiến hành dựng biểu đồ năng suất sinh sản của tế bào PK 15 tại thời điểm 48h nuôi ở các giá trị DO khác nhau như hình 4.3
Hình 4.3. Năng suất sinh sản của tế bào ở các giá trị DO khác nhau
Theo kết quả tại bảng 4.3 và hình 4.3 cho thấy:
sinh sản của tế bào cao nhất (2,53 lần). Trong khi lượng DO trong bình nuôi thấp (30-40%) làm cho quá trình sinh trưởng, trao đổi chất của các tế bào bị ức chế, tỉ lệ sinh sản của tế bào sau 48 giờ nuôi cấy kém (1,7 đến 2 lần). Bên cạnh đó, lượng DO cao 60% cũng không tốt cho quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, do lượng oxy hòa tan nhiều kết hợp với các chất thải ra trong quá trình trao đổi chất của tế bào tạo ra nhiều CO2 gây độc cho tế bào. Tỷ lệ sinh sản của tế bào sau 48 giờ nuôi cấy trong môi trường có giá trị DO 60% chỉ đạt (2,33 lần). Từ những kết quả khảo sát trên, chúng tôi lựa chọn giá trị DO thích hợp cho nuôi cấy tế bào PK 15 là 50% với quy mô 10 lít.
4.1.1.3. Xác định lưu lượng khí cấp vào thích hợp để nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
Hệ thống khí gồm 4 khí O2, N2, CO2 và không khí đuợc phối trộn tự động rồi theo ống dẫn đi vào trong bình nuôi cấy. Hệ thống cho phép cài đặt lưu lượng khí thích hợp cho việc nuôi tế bào. Lưu lượng khí tối đa đi vào bình nuôi cấy là 1 lít/phút. Để xác định lưu lượng khi phù hợp, chúng tôi đã khảo sát các mức lưu lượng khi khác nhau cho bình nuôi cây thu được kết quả như bảng 4.4.