Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.1. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thốngMicrocarrier
4.1.3. Xác định môi trường nuôi cấy và pH thích hợp cho tế bào PK 15 trên hệ
sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ.
Hình 4.6. Hình ảnh tế bào PK 15 trên Microcarrier
(a. Hình ảnh tế bào 24h; b. Hình ảnh tế bào 48h; c. Hình ảnh tế bào 72h; d. Hình ảnh tế bào 96h)
4.1.3. Xác định môi trường nuôi cấy và pH thích hợp cho tế bào PK 15 trên hệthống Microcarrier thống Microcarrier
4.1.3.1. Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
Năng suất sinh sản tế bào ảnh hưởng trực tiếp bởi môi trường nuôi không thích hợp. Để tìm ra công thức môi trường nuôi tối ưu nhất cho sự phát triển cũng như sự nhân của tế bào, tiến hành thí nghiệm nuôi cấy tế bào PK 15 trên 4 công thức môi trường khác nhau là MEM 5%FBS+KS, DMEM 5%FBS+KS, M199 5%FBS+KS và LH 5%FBS+KS. Sau 3 lô thử nghiệm liên tiếp với 4 loại môi trường nuôi cấy khác nhau, chúng tôi thu được các kết quả nghiên cứu như bảng 4.6
Bảng 4.6. Khả năng bám và phát triển tế bào PK 15 trên các loại môi trườngThời gian Thời gian theo dõi 24 48 72 96
Qua quá trình theo dõi ở cả 4 loại môi trường nuôi:
MEM 5% FBS+KS, DMEM 5% FBS+KS tế bào PK 15 sau 72-96 giờ nuôi tế bào bám kín tất cả các hạt Cytodex.
M199 5% KS và LH 5%FBS+KS tế bào PK 15 sau 96 giờ chỉ phủ 80- 90% hạt Cytodex.
Hiện tại, hệ thống nuôi trên chai T-fask 225cm2 chúng tôi đang sử dụng môi trường MEM 5% FBS+KS, nuôi 72 giờ, cho năng suất nhân là 5 lần.
Theo dõi thí nghiệm, tiến hành lấy mẫu theo dõi mức độ phát triển của tế bào trên kính hiển vi và đếm số tế bào sau 72 giờ. Kết quả thu được năng suất nhân của tế bào PK 15 trên từng loại môi trường nuôi khác nhau.
Bảng 4.7. Bảng năng suất tế bào PK 15 trên các loại môi trường tại thời điểm 72h nuôi cấy
Môi Lô 01 SLTB trường (×109) LH 3,3 M199 4,95 DMEM 5,25 MEM 6,33
Hình 4.7. Năng suất sinh sản của tế bào trên các môi trường nuôi
Mỗi một loại tế bào khác nhau sẽ phù hợp với các công thức môi trường nuôi khác nhau, cho nên phải tìm công thức môi trường nuôi thích hợp và tối ưu nhất cho tế bào. Lựa chọn được môi trường tối ưu nhất cần đủ hai yếu tố: tốc độ phát triển và năng suất nhân lên của tế bào. Từ kết quả bảng 4.6 và 4.7 môi trường MEM là môi trường nuôi tế bào PK 15 có tốc độ phát triển nhanh và mạnh nhất (sau 72 giờ nuôi tế bào bám 100%) và năng suất nhân lên của tế bào cao nhất (4,23 lần).
Sử dụng phần mềm Minitab 16 (ANOVA) nhận thấy P< 0,005; chúng tôi lựa chọn môi trường MEM bổ sung 5% FBS và kháng sinh là môi trường nuôi tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.1.3.2. Xác định môi pH thích hợp cho tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến khả năng bám hạt của tế bào PK 15 và năng suất sinh sản của tế bào qua 3 lô thí nghiệm được chúng tôi tổng hợp như bảng 4.8.
Bảng 4.8. Kết quả xác định tỉ lệ hạt có tế bào bám sau khi nuôi cấy 24h với các điều kiện pH khác nhau
pH
Kết quả trên cho thấy, nuôi tế bào PK 15 ở pH = 7,4±0,1 tỉ lệ tế bào sống bám hạt thấp nhất xấp xỉ 50%. Trong khi đó nuôi tế bào trong điều kiện pH = 7,0±0,1 cho tỉ lệ tế bào sống bám hạt cao trên 70%, đặc biệt ở pH = 7,0±0,1 cho tỉ lệ tế bào sống bám hạt cao nhất từ 80-90%. Tuy các tế bào đã bám hạt, nhưng năng suất sinh sản của tế bào sẽ khác nhau. Do vậy, kết quả theo dõi năng suất sinh sản của tế bào sau 72h nuôi cấy được tổng hợp như bảng 4.9:
Bảng 4.9. Kết quả xác định điều kiện pH thích hợp cho nuôi cấy tế bào PK 15 tại thời điểm 72h nuôi cấy
Lô 01 pH
7,0±0,1 7,2±0,1 7,4±0,1
Từ bảng 4.9 ta có đồ thị thể hiện năng suất sinh sản của tế bào như hình 4.8
Hình 4.8. Năng suất sinh sản của tế bào khi nuôi cấy ở các pH khác nhau
Tổng hợp kết quả bảng 4.8 và bảng 4.9 và hình 4.5 chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt rõ rệt khi nuôi tế bào PK- 15 trong điều kiện pH = 7,0±0,1 so với pH =7,4±0,1. Khi nuôi cấy tế bào PK 15 trong điều kiện pH 7,0±0,1 tế bào phát triển tốt cho năng suất sinh sản của tế bào cao hơn sau 72 giờ nuôi cấy. Không nên nuôi cấy tế bào trong điều kiện pH cao (pH=7,4±0,1) sẽ làm ảnh hưởng tới khả năng sống và năng suất sinh sản của tế bào.
Kết luận: Chọn pH = 7,0±0,1 là điều kiện pH tối ưu nhất cho nuôi cấy tế bào PK 15 quy mô 10 lít.
4.1.4. Xác định đường cong sinh trưởng tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
Tiến hành thí nghiệm và đếm số lượng tế bào tại các thời điểm 24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144h. Lặp lại thí nghiệm 3 lần thu được kết quả như sau:
Bảng 4.10. Kết quả số lượng tế bào PK 15 theo thời gian nuôi cấy trên Microcarrier
Lô thí nghiệm Lô 01 Lô 02 Lô 03 Trung bình NSSS trung bình
Từ kết quả bảng trên chúng tôi tiến hành dựng biểu đồ đường cong sinh trưởng tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier như hình:
Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier 10 lít cho thấy: Giai đoạn 24 giờ sau nuôi các tế bào mới bám hạt hầu như chưa phát triển. Sau 24h nuôi cấy, khi các tế bào đã bám lên hạt ổn định và bắt đầu pha sinh trưởng và đạt cao nhất ở 72h sau nuôi cấy (tỷ lệ sinh sản ~1:5,13) so với ban đầu. Ở giai đoạn sau 72h nuôi cấy, số lượng tế bào có hiện tượng giảm nhẹ do một số tế bào chết bong tróc vào môi trường. Tuy nhiên sau đó thì số lượng tế bào được duy trì tương đối ổn định do tế bào mới sinh ra lấp vào vị trí các tế bào chết đã bong.
Sau khi chốt các thông số cho quy trình nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier. Tôi tiến hành so sánh năng suất sinh sản tế bào thu được trên hệ thống Microcarrier với hệ thống T-flask đã được công ty áp dụng sản xuất trước đó tại các thời điểm thu hoạch: 24h, 48h, 72h, 96h thông qua đồ thị sau:
Hình 4.10. Đồ thị so sánh năng suất sinh sản tế bào thu được trên hệ thống Microcarrier và hệ thống T-flask
Nhìn vào hình 4.10 ta thấy năng suất sinh sản của tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier cao hơn T-flask tuy nhiên sự chênh lệch không nhiều. Khi xét về mật độ tế bào trên một thể tích nuôi cấy thì tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier cao hơn hẳn T-flask. Cụ thể tại thời điểm 72h nuôi cấy : trên T-flask thu được 320000 - 340000 tb/ ml còn trên hệ thống microcarrier thu được 770000 tb/ml. Như vậy, tế bào PK 15 nuôi trên hệ thống Microcarrier cao gấp 2 lần T-flask. Mặt khác, khi sử dụng công nghệ Microcarrier còn giảm thiểu nhận lực làm việc, giảm thiểu tạp trùng, hạn chế thao tác, hệ thống gọn không cồng kềnh, không
chiếm nhiều diện tích như T-flask. Chính vì vậy, tôi lựa chọn sản suất tế bào PK 15 bằng hệ thống Microcarrier.
4.2. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH GÂY NHIỄM VI RÚT DỊCH TẢ LỢN TRÊN MICROCARRIER