Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.2.1. Xác định môi trường duy trì sau gây nhiễm vi rút và pH của môi trường
duy trì
4.2.1.1. Xác định môi trường duy trì sau gây nhiễm vi rút
Môi trường duy trì tế bào sau nhiễm là môi trường nuôi tế bào có ít hoặc không có huyết thanh động vật. Môi trường duy trì có tác dụng duy trì sự sinh trưởng ổn định của tế bào tạo điều kiện tối ưu cho quá trình xâm nhập và nhân lên của vi rút.
Để tìm ra loại môi trường duy trì tế bào trong quá trình gây nhiễm vi rút đạt hiệu giá vi rút cao nhất khi thu hoạch. Tiến hành thử nghiệm trên 4 công thức môi trường: MEM, DMEM, M119 và LH. Tuy nhiên, sự duy trì sinh trưởng tế bào bị ảnh hưởng bởi hàm lượng huyết thanh và pH môi trường. Tất các công thức môi trường bổ sung 1% huyết thanh và pH=7,2±0,1 theo các nghiên cứu trên hệ thống chai Tflask.
Thí nghiệm được thực hiện 3 lần với các điều kiện nuôi tế bào, phương pháp gây nhiễm, thông số tối ưu giống nhau.
Kết quả theo dõi khả năng gây bệnh tích tế bào được thể hiện ở bảng 4.11. Bảng 4.11. Kết quả xác định hiệu giá vi rút DTL
trên các loại môi trường nhiễm
LH Lô 1 Lô 2 Lô 3 TB Từ bảng 4.11 ta có đồ thị hình 4.10
Hình 4.10. Đồ thị thể hiện hiệu giá trung bình (3 lô)của 4 loại môi trường duy trì của 4 loại môi trường duy trì
Nhìn vào kết quả ta thấy: Hiệu giá trung bình vi rút dịch tả lợn khi nuôi cấy bằng cả 4 loại môi trường đều cho hiệu giá vi rút chênh lệch nhau không nhiều. Tuy nhiên, môi trường MEM cho hiệu giá trung bình cao nhất ở cả 3 lô, trung bình 3 lô đạt 106,87±0,13 TCID50/ml. Môi trường LH hiệu giá trung bình 3 lô đạt 106,2±0,11TCID50/ml, môi trường M199 trung bình đạt 106,33±0,13TCID50/ml, Môi trường DMEM trung bình đạt 106,47±0,13TCID50/ml.
Sử dụng phần mềm Minitab 16 (ANOVA), P< 0,005. Như vậy, chúng tôi lựa chọn môi trường MEM 1% FBS có bổ sung 1% kháng sinh và 1% Hepes làm nuôi cấy để tiếp tục tiến hành các thử nghiệm tiếp theo đối với vi rút dịch tả lợn.
4.2.1.2. Xác định pH môi trường duy trì sau gây nhiễm vi rút
Sau khi xác định được môi trường duy trì cho nuôi cấy vi rút DTL tôi tiến hành xác định pH tối ưu để nuôi vi rút đạt hiệu quả cao. Tôi tiến hành thí nghiệm với pH = 7,0±0,1; pH= 7,2±0,1; pH= 7,4±0,1.
Kết quả được trình bày dưới bảng 4.12.
Bảng 4.12. Kết quả hiệu giá vi rút Dịch tả lợn ở các điều kiện pH khác nhau
Lô 1 Lô 2 Lô 3 Trung bình
Ở các điều kiện pH môi trường nuôi khác nhau thu được nguyên dịch vi rút với hiệu giá vi rút khác nhau. Tuy nhiên ở cả 3 lô thí nghiệm đều cho kết quả ở điều kiện môi trường nuôi có pH = 7,2±0,1 cho hiệu giá(106.9±0,12TCID50/ml)cao hơn hẳn môi trường nuôi pH = 7,0±0,1; pH = 7,4±0,1.
Sử dụng phần mềm Minitab 16 (ANOVA), P< 0,005 nên chúng tôi lựa chọn pH= 7,2±0,1 để nuôi vi rút DTL.
4.2.2. Xác định liều gây nhiễm (MOI) cho vi rút DTL
Để xác định liều gây nhiễm vi rút thích hợp tôi tiến hành thí nghiệm với 4 liều MOI khác nhau. Kết quả theo dõi thí nghiệm được trình bày tại bảng 4.13
Bảng 4.13. Kết quả hiệu giá vi rút của các liều gây nhiễm (MOI)
Thời gian gây nhiễm vi rút (giờ) 48h 54h 72h 96h
Từ bảng 4.13 chúng tôi tiến hành xây dựng đồ thị hình 4.11
Ở liều gây nhiễm 0,01 sau 48 giờ gây nhiễm hiệu giá vi rút đạt cao nhất, trung bình là 106,5 TCID50/ml và sau 54 giờ gây nhiễm vi rút hiệu giá bắt đầu giảm, theo dõi đến 96 giờ sau nhiễm hiệu giá vi rút còn 104,9 TCID50/ml.
Ở liều gây nhiễm 0,005 sau 48 giờ gây nhiễm hiệu giá vi rút đạt cao nhất, trung bình là 106,1 TCID50/ml và sau 54 giờ gây nhiễm vi rút hiệu giá bắt đầu giảm, theo dõi đến 96 giờ sau nhiễm hiệu giá vi rút còn 105,1 TCID50/ml.
Ở liều gây nhiễm 0,001 hiệu giá vi rút tăng dần theo thời gian gây nhiễm, hiệu giá đạt cao nhất sau 72 giờ gây nhiễm (107,1 TCID50/ml), sau 96 giờ nuôi nhiễm hiệu giá vi rút bắt đầu giảm dần.
Ở liều nhân nhiễm 0,0005 liều nhân nhiễm thấp, mức độ thể hiện CPE thấp nên hiệu giá vi rút đạt cao nhất sau 96 giờ gây nhiễm (106,7 TCID50/ml).
Sử dụng phần mềm minitab 16 (ANOVA), P< 0,005 nên chúng tôi sử dụng liều gây nhiễm 0,001 vi rút đạt hiệu giá cao nhất tại thời điểm 72h thu hoạch.