Tên
mồi Gen đích Trình tự (5’-3’) Tác giả
Ga G CCG GGA CAA GTA TCT CTA TGG Bayon-Auboyer
& cs. (1999)
Gy G TCT CGC TGA CAA ATT GGT CCT GA
Phản ứng PCR với cặp mồi Ga/Gy đã được tối ưu nồng độ mồi và nhiệt độ mồi, sử dụng đối chứng dương là virus tham chiếu chủng PL21 trong vacxin Nemovac. Thành phần phản ứng PCR (20μl) được phối trộn theo hướng dẫn của nhà sản xuất, trong đó: 17μl nước 3D + 1μl mồi Ga + 1μl mồi Gy + 1μl cDNA mẫu tách chiết.
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR được tóm tắt như sau: (i) 94oC trong 2 phút; (ii) 35 chu kì (94oC trong 20 giây, 50oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây); (iii) 72oC trong 5 phút.
Sản phẩm PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trong thạch agarose 1,5%, có bổ sung dung dịch nhuộm RedsafeTM.
3.5.5. Phương pháp phân tích trình tự gen
Sản phẩm RT-PCR sau khi được tinh sạch và giải trình tự (theo hai là chiều xuôi, chiều ngược) bằng phương pháp Sanger, được thực hiện bởi công ty 1st BASE (Malaysia). Các phần mềm tin sinh học chuyên dụng như BioEdit, DnaSP được dùng để xác định đặc các điểm của trình tự gen như: % tương đồng trình tựnucleotide, % tương đồng trình tự amino acid, đa hình nucleotide, các vị trí có đột biến thêm- xóa, các vị trí/ trình tự nucleotide bảo thủ, codon usage bias, v.v...
Phần mềm MEGA và BEAST được sử dụng để xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa vào các gen mã hóa protein của mỗi loại virus, dựa trên cơ sở dữ liệu là các trình tự gen đã công bố tại GenBank. Thuật toán dựng cây phát sinh chủng loại là Neighbor joining hoặc Maximum likelihood, với số lần thực hiện phân tích bootstrap là 1000 lần. Biểu diễn và hiệu chỉnh cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm FigTree v1.4.3.
3.5.6. Phương pháp ELISA gián tiếp
Kháng thểđặc hiệu kháng aMPV được phát hiện bằng phương pháp ELISA gián tiếp, sử dụng bộ kít Kit ELISA ID Screen Avian Metapneumovirus Indirect 5P (IDVET_MPVS-5P, IDvet).. Pha loãng huyết thanh và các bước thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Qui trình được thực hiện tóm tắt các bước như sau:: (i) pha loãng mẫu với Dilution Buffer, thêm vào đĩa; (ii) ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, rửa bằng Wash solution; (iii) thêm Conjugate 1X; (iv) ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, rửa; (v) thêm Substrate Solution; (vi) ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng, chú ý tránh ánh sáng; (vii) thêm Stop solution để dừng phản ứng. Kết quả được đọc ở bước sóng 450nm. Sự có mặt của kháng thể kháng aMPV trong các mẫu huyết thanh được xác định bằng mật độ quang (OD- optical density) trên cơ sở tính toán tỷ số dương tính (S/P). Nếu S/P ≤0,20 được xem là mẫu dương tính. Giá trị hiệu giá kháng thể(Titer) được tính theo công thức như sau:
Log10(titer)=1,09 * log10 (S/P) + 3,360 Hiệu giá kháng thể= 10 log
3.5.7. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học
Phương pháp dịch tễ học mô tả: Được sử dụng để nghiên cứu các đặc điểm dương tính huyết thanh học theo các đặc điểm địa phương, giống loài, lứa tuổi, loại hình chuồng trại, quy mô.
Các mẫu được mã hóa kết hợp với thông tin được thu thập về các yếu tố như: địa phương, giống loài, loại hình chuồng trại, quy mô chăn nuôi, tình trạng sử dụng vacxin phòng vac xin aMPV, biểu hiện triệu chứng, bệnh tích.
3.5.8. Xử lý số liệu
Tỷ lệlưu hành của virus được tính toán các tiêu chí: lứa tuổi, loại hình chăn nuôi, địa điểm, v.v... Các bước tính toán và phân tích thống kê được thực hiện trên phần mềm Excel, Minitab 17, SPSS. Các phép tính thống kê được sử dụng là t-test, one-way ANOVA. Giá trị p < 0,05 được xác định là giới hạn sai khác có ý nghĩa thống kê.
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Nghiên cứu này đã xác định sự lưu hành huyết thanh học và virus học của aMPV ở gà tại 10 tỉnh miền Bắc. Kết quảđược trình bày ở phần 4.1 và 4.2.
4.1. SỰLƯU HÀNH KHÁNG THỂ KHÁNG aMPV 4.1.1. Tỷ lệdương tính huyết thanh họctheo địa phương
Kết quảđịnh tính phản ứng ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng aMPV ở 359 mẫu huyết thanh, từ 29 trang trại nuôi gà chưa từng sử dụng vacxin aMPV thuộc 10 tỉnh miền Bắc được minh họa ở hình 4.1.
Ghi chú: đối chứng âm (-), đối chứng dương (+)
Ở giếng đối chứng âm chuẩn không thấy xuất hiện màu, trong khi đó giếng đối chứng dương hiện màu vàng đậm (hình 4.1). Dựa vào màu, các mẫu có màu được xác định là có kháng thể kháng aMPV. Thống kê tỷ lệ mẫu dương tính huyết thanh học với aMPV theo địa phương và trang trại được trình bày ở bảng 4.1 và hình 4.2.
Bảng 4.1. Kết quảxác định dương tính huyết thanh học theo số mẫu và theo trại ởcác địa phương
Địa phương
Theo mẫu xét nghiệm Theo trang trại có mẫu xét nghiệm Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) Số trại lấy mẫu Số trại dương tính Tỷ lệ (%) Bắc Ninh 53 33 62,3% 5 5 100,0% Hà Nam 39 38 97,4% 3 3 100,0% Hà Nội 46 6 13,0% 3 1 33,3% Hải Phòng 15 0 0,0% 1 0 0,0% Hòa Bình 30 12 40,0% 2 2 100,0% Phú Thọ 34 2 5,9% 3 2 66,7% Quảng Ninh 45 4 8,9% 4 2 50,0% Thái Bình 11 0 0,0% 1 0 0,0% Thái Nguyên 64 14 21,9% 5 5 100,0% Yên Bái 22 21 95,5% 2 2 100,0% Tổng hợp 359 130 36,2% 29 22 75,9%
Kết quả bảng 4.1, xác định được 130/359 mẫu huyết thanh gà có kháng thể kháng aMPV, tương đương tỷ lệ dương tính trung bình của các cá thể trong các đàn khảo sát là 36,2%. Đã xác định được 22 trang trại trong tổng 29 trang trại khảo sát với ít nhất một mẫu huyết thanh dương tính (giá trị S/P ≥ 0,2) với kháng thể kháng aMPV. Tỷ lệnày tương đương với 75,9 % các đàn gà (chưa từng được phòng vacxin aMPV) dương tính tự nhiên với kháng thể kháng aMPV.
Hình 4.2. Tỷ lệdương tính kháng thể kháng aMPV theo địa điểm
Mức độlưu hành huyết thanh học trong đàn gà ghi nhận ở đây không cao so với tỷ lệdương tính huyết thanh học với kháng thể kháng aMPV là 53,29% ở gà nuôi tại Bangladesh (Ali & cs., 2019). Ngược lại, tỷ lệdương tính ở hình 4.2 khá tương đồng mức độlưu hành tại Jordan (Gharaibeh S. M. & Algharaibeh, 2007) và Ai Cập (Nagy & cs., 2018) ở tỷ lệxác định được 21,7%. Kết quả này thấp hơn rất nhiều với mức độ lưu hành trên các đàn gà có biểu hiện sưng phù đầu, quanh mắt, ức và cổ tại Đài Loan (86,4%) (Lu & cs., 1994). Điều này, có lẽ do các mẫu đã được lấy ngẫu nhiên từ các trang trại bao gồm cả có và không có tiền sử hay hiện tại liên quan tới hội chứng sưng phù đầu hoặc rối loạn hô hấp.
Kết quả trình bày tại hình 4.2A và hình 4.2B cho thấy giữa các địa phương cũng có sự khác biệt về tỷ lệ các mẫu và tỷ lệ trang trại có mẫu huyết thanh dương tính với kháng thể kháng aMPV. Trong đó, đáng chú ý các địa phương có tỷ lệdương tính huyết thanh học cao là Hà Nam với 97,4% mẫu huyết thanh, 100% số trang trại; Yên Bái với 95,5% mẫu huyết thanh và 100% trang trại có ít nhất một mẫu có kháng thể kháng aMPV, các tỷ lệ này ghi nhận tuy có
thấp hơn song vẫn ở mức độ từ trung bình tới cao tại Bắc Ninh với 62,3% và 100%; Hòa Bình là 40,0% và 100%; Bắc Ninh 38,1% và 100%; Thái Nguyên 21,9% và 100%. Ngược lại các vùng chăn nuôi khác như Hà Nội, Phú Thọ, Quảng Ninh có tỷ lệ dương tính thấp hơn chỉ ở mức 5,9%-13,0% song tỷ lệ trại dương tính lại khá cao và rất biến động (từ 33,3%- 66,7%).
Theo các số liệu thống kê (Tổng Cục Thống Kê, 2019) thì Hà Nội, Phú Thọ, Quảng Ninh, Bắc Ninh, Thái Nguyên, Hòa Bình là các địa phương quy mô/mật độ nuôi lớn tại khu vực miền Bắc, song tỷ lệ dương tính huyết thanh học kháng thể kháng aMPV lại rất thấp. Điều này có thể do giới hạn của khảo sát, các mẫu thu thập chỉ được thực hiện tại các đàn gà chưa sử dụng vacxin aMPV. Theo điều tra trước khi thực hiện lấy mẫu, trong khoảng thời gian từ cuối năm 2017 đến nay, tại các vùng này đã và đang áp dụng vacxin phòng aMPV cho các đàn gà. Do đó việc lựa chọn trang trại đủ điều kiện chưa chủng với vacxin aMPV để lấy mẫu là rất khó nên số lượng mẫu thu thập được khá thấp ở tại các khu vực này. Vì thế, mức độ dương tính huyết thanh học với aMPV ở các trang trại chăn nuôi thuộc các tỉnh thành này chưa phản ánh đúng tình trạng dương tính.
Cho đến nay, nhiều mầm bệnh hô hấp ởgà được khẳng định có mặt tại Việt Nam (Hảo, 2008; Trương Hà Thái & cs., 2009; Nguyễn Bá Tiếp & cs., 2016; Nguyễn Thị Lan & cs., 2016; Nguyễn Thị Loan & cs., 2017). Kết quả khẳng định sự có mặt của aMPV của nghiên cứu này càng cho thấy tính chất phức tạp của nhóm bệnh hô hấp xảy ra ở gà tại nước ta.
4.1.2. Tỷ lệdương tính huyết thanh học theo giống gà
Các nghiên cứu trước đây về sự lưu hành huyết thanh học của aMPV chủ yếu tập trung vào liên quan tới gà tây (Toro & cs., 1998), gà trắng thương phẩm, gà đẻ siêu trứng thương phẩm và gà bố mẹ (Chettle & Wyeth, 1988; Baxter‐Jones & cs., 1989; Eterradossi & cs., 1995; Chiang & cs., 2000; Alkahalaf & cs., 2002). Theo Aung Ye Htut (2007) cho đến nay, rất ít nghiên cứu về tỷ lệ lưu hành huyết thanh học ở các đàn gà nhà, mà đặc biệt là các nhóm gia cầm bản địa lai với các giống cao sản ngoại nhập. Vì vậy, nghiên cứu đã thực hiện xác định tỷ lệ lưu hành huyết thanh học của aMPV trên các giống gà nuôi phổ biến tại tại các trang trại miền Bắc hiện nay. Kết quả được trình bày trong bảng 4.2.
Bảng 4.2. Tỷ lệ dương tính huyết thanh học theo giống gà Nhóm gà Giống gà Số mẫu Nhóm gà Giống gà Số mẫu kiểm tra Tỷ lệ dương tính (%) Trung bình (%) Siêu thịt Ross 308 49 8,2 8,2 Bản địa lai Gà Ai Cập trắng lai 21 0,0 35,0 Gà J Hòa Phát 14 100,0 Gà J Dabaco 28 71,4 Gà J Japfa 11 18,2 Gà J Mavin 9 11,1 Gà lai chọi 66 19,7 Gà Tiến Đạt 10 20,0
Gà Mía x Lương Phượng 12 0,0
Gà Thanh Lương 12 100,0 Bản địa Gà Minh Dư 10 100,0 48,8 Gà Ri 11 36,2 Gà Hồ 90 42,2 Gà Lạc Thủy 16 62,5 Tổng hợp 359 36,2
Kết quả bảng 4.2 cho thấy mức độ dương tính huyết thanh học với aMPV giữa các giống gà thì có sự khác biệt. Đáng chú ý ở đây là tỷ lệ cao nhất các gà thuộc nhóm gà bản địa của nước ta bao gồm gà Minh Dư (gà bản địa Bình Định) dương tính 100,0%, Lạc Thủy (gà bản địa vùng Lạc Thủy Hòa Bình) 62,5% sau đó đến gà Hồ (42,2%), gà Ri bản địa (36,2%). Trong khi đó tỷ lệ này rất biến động ở nhóm gà lai (giữa một giống bản địa và một giống ngoại nhập). Cụ thể, tỷ lệdương tính cao nhất ghi nhận ở gà J Hòa Phát và gà Thanh Lương với 100% số mẫu phát hiện dương tính kháng thể, tiếp theo là gà J Dabaco 71,4%, thấp hơn ở gà Tiến Đạt (con gà Chọi lai Lương phượng) (20,0%), Lai Chọi (19,7%), J Japfa (18,2%), J Mavin (11,1%). Gà trắng siêu thịt Ross 308 xác định được tỷ lệ mẫu huyết thanh dương tính với kháng thể kháng aMPV chỉở mức 8,2%. Không phát hiện được mẫu dương tính huyết thanh học được ghi nhận là ở các gà Ai Cập lai, và gà Mía lai Lương Phượng.
Kết quả trình bày trong bảng 4.2 cho thấy nhóm gà bản địa có mức độ lưu hành huyết thanh ở mức 48,8% cao hơn khoảng 13,8% so với tỷ lệ35,0% dương tính ởnhóm gà lai. Đặc biệt tỷ lệdương tính ở gà trắng siêu thịt lại rất thấp 8,2%.
Tỷ lệ dương tính ở nhóm gà lai khá tương đồng với các khảo sát huyết thanh học thực hiện trước đây trên các đàn gà thịt giống bản địa và bản địa lai như: giống gà lai Sonali (con lai giữa gà trống Rhode Island Red x gà mái bản địa Fayoumi) tại Bangladesh ghi nhận được 35,57% dương tính huyết thanh học kháng aMPV (Ali & cs., 2019). Song tỷ lệdương tính thu được chiếm đến gần ½ số mẫu ở nhóm gà bản địa (48,8%) lại chưa phù hợp do thấp hơn nhiều so với tỷ lệ dương tính ở giống gà bản địa (Hanhyup-3) của Hàn Quốc với 78,2%. Điều này tương tự ở các kết quảdương tính huyết thanh học (8,2%) từ các mẫu thu được từ gà trắng siêu thịt với tỷ lệxác định được trong khảo sát cũng rất thấp so với mức dương tính lần lượt tại Hàn Quốc là 60,1% và 79,2% ở gà siêu thịt trắng Cobb, Ross (Lee & cs., 2006).
Mặc dầu so sánh ở trên tỷ lệ dương tính huyết thanh học thấp hơn so với các nghiên cứu đã thực hiện, song lại thống nhất vềđặc điểm mức độ dương tính ở các gà bản địa thường cao hơn các kết quả của ghi nhận được trên giống gà trắng siêu thịt, gà lai. Các kết quả trên là hoàn toàn phù hợp kết luận được rút ra từ nghiên cứu trước đây là: mức độ dương tính và hiệu giá kháng thể ở gà thịt thường thấp hơn gà đẻ, hoặc gà đẻ giống (Pattison & cs., 1989; Minta & cs., 1995). Các kết quả và phân tích trên có thể thấy rằng ở những giống gà bản địa có tỷ lệ dương tính cao hơn so với các giống gà lai, và các giống nhập nội. Do đó, các trang trại cần lưu tâm trong khâu chọn giống, cũng như có quy trình vacxin phòng aMPV.
4.1.3. Tỷ lệdương tính huyết thanh học theo lứa tuổi gà
Trong giai đoạn úm (0-21 ngày tuổi) có thể phát hiện thấy kháng thể trong các mẫu huyết thanh song đó là kháng thể thụ động kháng aMPV do mẹ truyền sang con (Catelli E. & cs., 1998). Bên cạnh đó quy luật thải trừ kháng thể ở gà thịt đã được xác định bởi Aung Ye Htut (2007). Thời gian bán thải ước đoán 3-4 ngày, và khoảng 80% các cá thể gà thịt trong đàn sẽ âm tính với kháng thể mẹ truyền trong khoảng 11-19 ngày tuổi. Thực tếchăn nuôi hiện nay, mặc dầu chưa có bất kỳ xác nhận nào về bệnh gây ra bởi aMPV tại Việt Nam, song các trang trại gà giống bố mẹthường áp dụng quy trình vacxin có aMPV vô hoạt trước khi gà bố mẹ chuyển sang giai đoạn đẻ trứng. Do đó, nghiên cứu đã khảo sát dương tính kháng thể kháng aMPV trên các đàn gà ở các lứa tuổi theo các giai đoạn sinh trưởng chính. Để loại trừdương tính do kháng thể thụ động từ mẹ truyền, nghiên cứu chỉ thực hiện trên các mẫu huyết thanh thu được ở gà từ 22 ngày tuổi tới xuất bán (hình 4.3, và bảng 4.3).
Bảng 4.3. Tỷ lệ dương tính huyết thanh học theo nhóm tuổi Loại gà Nhóm tuổi (ngày) 22-42 43-90 91-120 >120 SM + (%) SM + (%) SM + (%) SM + (%) Gà bản địa 10,0 50,0 60,0 36,7 46,0 67,4 11,0 36,4 Gà bản địa lai 53,0 24,5 111,0 37,8 19,0 47,4 - - Gà trắng thịt 15,0 0,0 34,0 11,8 - - - - Tổnghợp 78 23,1 205 33,2 65 61,5 11 36,4
Chú thích: “ –“ Không khảo sát; “SM”: tổng mẫu của nhóm; + (%): tỷ lệ % mẫu có kháng thể kháng aMPV
Kết quả bảng 4.3 và hình 4.3 cho biết: nhìn chung tất cả lứa tuổi gà đều dương tính với kháng thể kháng aMPV. Mức độ lưu hành huyết thanh học kháng aMPV tính chung theo nhóm tuổi có xu hướng tăng dần, gà càng nuôi dài ngày thì càng có tỷ lệdương tính cao. Tỷ lệdương tính theo nhóm tuổi tính chung của 3 nhóm gà cho thấy rõ đặc điểm trên: 23,1% (22- 42 ngày); 33,2% (43- 90 ngày); 61,5% (91- 120 ngày) và 36,4% (> 120 ngày). Giai đoạn gà giò (22-42 ngày tuổi), tỷ lệ dương tính ở nhóm gà bản địa khá cao (50,0%), mức độ thấp hơn ở nhóm gà lai (24,5%). Ngược lại không ghi nhận kết quả dương tính nào ở gà trắng thịt. Đáng chú ý theo quy luật, từ giai đoạn này kháng thể thụ động do mẹ truyền không còn tồn tại trong đàn gà khảo sát (Aung Ye Htut, 2007). Thực tế rằng, các đàn gà này chưa từng sử dụng vacxin phòng aMPV, do đó kháng thể này là kết quả sựphơi nhiễm với aMPV tự nhiên.
Kết quảthu được ở nhóm gà bản địa và gà lai trong giai đoạn 3-6 tuần tuổi (22-42 ngày) là phù hợp, trong khi đó ở nhóm gà trắng siêu thịt là chưa phù hợp