L ỜI CẢM ƠN
2.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ AMPV
Nghiên cứu về hội chứng hô hấp phức hợp ở gà và vai trò của các loại vi khuẩn, virus có vai trò quan trọng đối với bệnh cũng chưa được quan tâm nghiên cứu đúng mức ở Việt Nam. Trong nhiều năm qua, chỉ có một số ít mầm bệnh, đã được nghiên cứu.
Các chủng Mycoplasma spp phổ biến gây bệnh ở đàn gà tại Việt Nam đã được xác định bao gồm Mycoplasma synoviae và Mycoplasma gallisepticum, các mầm bệnh này được đánh giá như lànguyên nhân hàng đầu đóng góp vai trò nhất định trong hội chứng hô hấp phức hợp ở đàn gà nuôi tại miền Bắc Việt Nam (Hảo, 2008). Sự lưu hành huyết thanh học với kháng thể kháng Mycoplasma gallisepticum nguyên nhân gây bệnh hô hấp mạn tính (CRD) đã được khảo sát tại Miền Bắc với tỷ lệ 37,83% (Trương Hà Thái & cs., 2009) và gần đây là 29,69% (Nguyễn Bá Tiếp & cs., 2016).
Ngoài ra gần đây cũng ghi nhận sự tồn tại của nhiều mầm bệnh mới nổi có liên quan tới hội chứng hô hấp trên gia cầm như virus Infectious bronchitis virus
do biến chủng gây thể thận (IBV 793B), thể báng nước ống dẫn trứng (IBV QX like) (Nguyễn Thị Loan & cs., 2017), cúm gia cầm độc lực thấp do AIV H9 (Thuy & cs., 2016); bệnh Newcastle thể độc lực cao do Newcaslte disease virus
genotype VII (Choi & cs., 2014), Ornithobacterium rhinotracheale (Thị Lan & cs., 2016).
Hội chứng sưng phù đầu do virus (SHS) là một bệnh hô hấp trên gà ít được biết đến ở Việt Nam. Cho đến nay, bệnh mới chỉ được suy đoán trong thực tế chăn nuôi từ các kỹ thuật quản lý trang trại và người chăn nuôi, mà chưa từng có một nghiên cứu xác định sự tồn tại của aMPV gây bệnh và vai trò của nó trong hội chứng hô hấp phức hợp ở gà.
2.3.2. Nghiên cứu nước ngoài
2.3.2.1. Nghiên cứu lưu hành huyết thanh học aMPV bằng phản ứng ELISA
Việc chẩn đoán sự nhiễm trùng của virus aMPV dựa trên phân lập virus là rất khó và cần nhiều thời gian (Cook J. K. A. & cs., 1993b; Jing & cs., 1993). Kháng thể có thể tồn tại khá lâu, thậm chí có thể phát hiện đến 89 ngày sau nhiễm (Jones & cs., 1988). Đánh giá sựlưu hành huyết thanh thông qua phát hiện kháng thể kháng aMPV một mặt vừa nhanh và kinh tế hơn do có thể thực hiện được nhiều mẫu cùng lúc, thực hiện được trên quy mô rộng hơn khi so sánh với việc phân lập virus (Baxter‐Jones & cs., 1989; Jing & cs., 1993; Goyal & cs., 2000; Brown Paul Alun, 2007).
Xác định sự lưu hành huyết thanh học với kháng thể kháng aMPV có thể được sử dụng để phát hiện sựđáp ứng miễn dịch trong trường hợp chủng vacxin và khảo sát khả năng phơi nhiễm aMPV trong thực địa ở các đàn gà chưa từng chủng vacxin (Cook Jane & cs., 1988; Gough & cs., 1988; A Williams & cs., 1991; Cook J. K. & cs., 1993a).
Các nghiên cứu lưu hành huyết thanh học chủ yếu sử dụng phản ứng ELISA và đã được thực hiện tại nhiều quốc gia. Các nghiên cứu này chủ yếu tập trung ở gà tây (Chiang & cs., 2000; Goyal & cs., 2003), mà chưa có nhiều các nghiên cứu ở gà nhà (Aung Ye Htut, 2007).
Ở gà con có thể có kháng thể thụ động kháng aMPV do mẹ truyền qua trứng (Catelli E. & cs., 1998). Song các kháng thể này có thể sẽ không bảo hộ được cho gà con trước sự tấn công của chủng cường độc (Naylor Cj & cs., 1997b). Gà đã xác nhận dương tính kháng thể kháng aMPV vẫn có thể bị nhiễm
virus aMPV và có các biểu hiện lâm sàng của bệnh (Catelli Elena & cs., 2004). Aung Ye Htut (2007) đã xác định được 80% các gà thịt sẽ âm tính với kháng thể mẹ truyền trong khoảng 11-19 ngày tuổi, thời gian bán thải ước đoán 3-4 ngày. Trong khi đó gà đẻ hậu bị con có kháng thể mẹ truyền sẽ sụt giảm kháng thể ở 2-3 tuần tuổi. Đồng thời phát hiện sau giai đoạn sau đó ở 4-6 tuần tuổi ghi nhận kháng thể có hiện tương tăng trở lại mặc dầu chưa từng làm vacxin, điều này có thể do sự phơi nhiễm tự nhiên với virus aMPV sau khi kháng thể mẹ truyền không còn khảnăng bảo hộở 2-3 tuần tuổi (Rivera-Benitez & cs., 2014).
Các nghiên cứu giám sát huyết thanh học kháng aMPV ở gà thịt thường cho tỷ lệdương tính thấp hơn ởgà đẻ, hoặc gà đẻ giống, điều này có thể do thời gian nuôi của gà thịt thường ngắn, trong khi gà đẻ và gà giống thời gian sống lâu hơn nên có thời gian phơi nhiễm với aMPV cao hơn (Minta & cs., 1995; Rahimi, 2011). Gà hậu bị và gà giống cũng thường có mức độdương tính huyết thanh học rất cao từ 88,03% tới 99,6%. Đặc biệt, bắt đầu tuần thứ 12 thì hầu hết các đàn có lẽ đã phơi nhiễm aMPV (Rivera-Benitez & cs., 2014). Mức độ dương tính thường được ghi nhận cao hơn ở gà giống > 41 tuần tuổi (Ali & cs., 2019). Như vậy có thể có nguy cơ đàn gà bố mẹ sẽ truyền dọc cho con, cũng như gà con có thể có kháng thể kháng aMPV do được truyền từ gà mẹđã phơi nhiễm với aMPV trước đó.
Tỷ lệ lưu hành dương tính huyết thanh học so sánh giữa các giống gà bản địa hoặc gà lai với các giống gà nhập nội, cao sản cũng đã được thực hiện. Lee & cs. (2006) xác định tỷ lệ lưu hành huyết thanh học của aMPV ở gà tại tỉnh Joenbuk Hàn Quốc thấy rằng tỷ lệ dương tính theo loài là gà trắng thịt thương phẩm Cobb, Ross, và giống gà bản địa Hanhyup-3 cho thấy tỷ lệdương tính theo đàn là 100% các đàn, song tỷ lệ mắc trong đàn lần lượt là 60,1%, 79,2% và 78,2% tỷ lệ S/P trung bình lần lượt là 1,677; 1,769 và 2,254. Ali & cs. (2019) cũng xác định được tại Bangladesh, mức độ dương tính huyết thanh học ở giống gà lai Sonali (bản địa và Rhode Island) cho tỷ lệ 35,57%, thấp hơn nhiều so với các gà giống cao sản (72,30%) và gà đẻ thương phẩm (50,85%). Như vậy, các đặc điểm di truyền (giống loài), có vẻcũng ảnh hưởng tới mức độlưu hành huyết thanh học kháng aMPV ởđàn gà.
Tỷ lệdương tính huyết thanh học với aMPV thường cao hơn vào mùa mưa và mùa đông 53,12% (341/642), và 68,21% (517/758), trong khi đó mùa hè thấp hơn với 32,14% (170/529) (Ali & cs., 2019).
Mặc dù vậy, Ganapathy & cs. (2010) gợi ý rằng không phải lúc nào mức độ dương tính của phản ứng ELISA cũng phản ánh đúng tỷ lệ phơi nhiễm của đàn gà, vì miễn dịch ở đàn gà do aMPV không nhất thiết có kháng thể dịch thể, mức độ kháng thể tại thời điểm lấy mẫu cũng có thểkhông đủđể phát hiện.
Khi nghiên cứu lưu hành huyết thanh học trên diện rộng, Maherchandani & cs. (2004) đề xuất cách lấy mẫu huyết thanh gộp. Phương pháp mẫu gộp so sánh với mẫu đơn lẻ cho thấy mức độ nhạy không đổi, chi phí đã giảm. Các kết quả này chi tiết bao gồm “mức độ lưu hành giảđịnh là 5%-20% sẽ có khảnăng phát hiện gia tăng từ 0,501 tới 0,967 phụ thuộc vào giá trị cutoff và số mẫu gộp từ 2-7 mẫu/mẫu gộp. Sau đó, nhiều nghiên cứu đã ứng dụng và khẳng định tính hiệu quả của phương pháp này (Gharaibeh S. M. & Algharaibeh, 2007); Seifi & Boroomand (2015).
2.3.2.2. Nghiên cứu lưu hành dịch tễ học phân tử
Quy trình chẩn đoán sinh học phân tử xác định aMPV sử dụng phương pháp RT-PCR đã được phát triển, cho phép phát hiện nhanh, nhạy cao và đặc hiệu (Juhasz & Easton, 1994; Bayon-Auboyer & cs., 1999).
Các trình tự mồi để phát hiện tất cả các subtype (Bayon-Auboyer & cs., 1999; Cecchinato & cs., 2004), hoặc đặc hiệu cho từng subtype từ A-D cũng đã được phát triển (Bayon-Auboyer & cs., 1999; Shin H. J. & cs., 2000b).
Giải trình tựđã được thực hiện trên tất cả các gen, vùng chuyển tiếp của các aMPV/A, aMPV/B, aMPV/C, aMPV/D (Bäyon-Auboyer & cs., 2000; Shin Hyun-Jin & cs., 2002; Brown Paul A. & cs., 2014; Laconi & cs., 2016). Các gen mã hóa protein G, M, N, P, và F đều có tính đa dạng cao nên có thể dựa vào trình tự gen của chúng để phân loại virus (Chacon & cs., 2011) hoặc thiết kế các cặp mồi đặc hiệu giám định subtype (Bayon-Auboyer & cs., 1999; Bäyon-Auboyer & cs., 2000; Shin H. J. & cs., 2000b).
Gen mã hóa Protein G có tính đa dạng cao thậm chí ngay trong 1 subtype nên gen mã hóa Protein G giữ vai trò quan trọng trong sự tiến hóa của virus (Easton & cs., 2004; Cecchinato & cs., 2010). Nó có vai trò quan trọng đối với độc lực và tính sinh miễn dịch của aMPV (Govindarajan & cs., 2010). Chính vì thế nó được sử dụng nghiên cứu đặc tính di truyền, phân loại virus thành các nhóm (Bäyon-Auboyer & cs., 2000), sự đa dạng về kháng nguyên (Cook J. K. A., 2000) và đáp ứng miễn dịch, phát triển vacxin (Catelli Elena & cs., 2010).
aMPV thường được phát hiện trong các đàn gà có biểu hiện rối loạn hô hấp (Tucciarone & cs., 2018). Các biểu hiện thường thấy rất đa dạng từ hen nhẹ tới trụy hô hấp (Umar & cs., 2019). Virus cũng có thể lưu hành trong đàn gà mà không gây ra triệu chứng của bệnh (Andreopoulou & cs., 2019).
Nhiều trường hợp dương tính với RT-PCR nhưng không thể phân lập được virus (Kwon & cs., 2010). Nguyên nhân của điều này là do virus tồn tại thường ở giai đoạn đầu của bệnh và sự thích nghi trên các vật chủ khác nhau là khác nhau (Kong & cs., 2008; Velayudhan & cs., 2008). Cook J. K. A. & cs. (1993b) phát hiện thấy độc lực của aMPV ở gà và gà tây có sự khác biệt. Điều này cũng là một trong những nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ lưu hành huyết thanh học xác định được thường cao hơn tỷ lệlưu hành virus xác định trong các đàn gà (Gharaibeh S. M. & Algharaibeh, 2007).
Các aMPV/A, aMPV/B, aMPV/C ở gà nhà và gà tây có vẻ có cùng nguồn gốc (Tucciarone & cs., 2018) và gần gũi về tính kháng nguyên (Cook J. K. A. & cs., 1993b). Dưới điều kiện thí nghiệm đã chứng minh, aMPV/A và aMPV/B chủ yếu chỉ gây bệnh ở gà tây và gà nhà. Trong khi đó aMPV/C phân lập được từ gà tây có thể gây bệnh cho gà nhà, aMPV/C phân lập từ ngan pháp có ký chủ chính là thủy cầm, song có thể thấy có hiện tượng chuyển huyết thanh aMPV/C phân lập gà tây trên vịt và gà nhà, gà tây có hiện tượng chuyển huyết thanh từ aMPV/C phân lập từ vịt (Brown P. A. & cs., 2019). Thực tế, gà nhà đến nay lưu hành chủ yếu là aMPV/A và aMPV/B (Aung Ye Htut, 2007; Rahimi, 2011). aMPV/C gây bệnh ở gà nhà mới chỉ phát hiện giới hạn tại Trung Quốc (Wei & cs., 2013). Chưa từng ghi nhận aMPV/D gây bệnh trong tự nhiên với gà nhà mặc dầu trong thí nghiệm công cường độc có thể thấy dương tính huyết thanh học ở gà nhà mặc dù không phát hiện được virus hay triệu chứng (Brown P. A. & cs., 2019).
Cho tới nay có rất ít các nghiên cứu về đặc điểm bệnh học phân tử gây ra bởi aMPV/A, B ở gà nhà (Aung Y. H. & cs., 2008).
Các aMPV/A và aMPV/B đã được xác nhận ở gà nuôi tại hầu hết các quốc gia trên thế giới. Sựlưu hành đồng thời của aMPV/A và aMPV/B cũng được ghi nhận ở nhiều quốc gia tại Châu Âu: Bỉ (Van De Zande & cs., 1998), Đức (Hafez & cs., 2000), Anh… Châu Á: Isarel (Banet-Noach & cs., 2005), Trung Quốc (Owoade & cs., 2008; Yu M. & cs., 2019), Nhật Bản (Mase & cs., 2003), Hàn quốc (Kwon & cs., 2010).
aMPV/B là subtype lưu hành phổ biến nhất trong 4 subtype (Banet-Noach & cs., 2005). Theo thời gian, aMPV/B luôn được xác nhận trong suốt chiều dài lịch sử phát hiện bệnh tại Châu Âu. Các nghiên cứu tại Pháp cho thấy trong giai đoạn 1985 có sựlưu hành aMPV/D ở gà tây, nhưng từ 95-97 không phát hiện trở lại mà chỉ phát hiện thấy aMPV/B (Bayon-Auboyer & cs., 1999). Tại Anh trong giai đoạn 1985-1990 có sựlưu hành của cả02 sutype A, B, song sau đó từ 1994- 1995 chỉ có sựlưu hành của aMPV/B (Naylor C. & cs., 1997a). Tucciarone & cs. (2018) cũng chỉ ghi nhận sự lưu hành của aMPV/B tại Ý, mà không phát hiện thấy aMPV/A. Trong khi trong những thập niên trước 1990, aMPV/A đã từng lưu hành tại đây (Lupini Caterina & cs., 2011). Hafez & cs. (2000) ghi nhận các đàn gà tây tại Đức trong những năm 1987-1988 lưu hành aMPV/A trong khi ở gà thịt giống thuộc aMPV/B. Song gần đây chủ yếu ở gà thịt aMPV/B vẫn là subtype lưu hành chính. Ngoài sự lưu hành phổ biến tại châu Âu (Naylor C. & cs., 1997a; Van De Zande & cs., 1998; Hafez & cs., 2000), aMPV/B cũng được xác định là subtype chính của aMPV tại nhiều khu vực khác trên thế giới (Banet- Noach & cs., 2005; Chacón & cs., 2007; Choi & cs., 2009).
Naylor C. J. & Jones (1994) ghi nhận hiện tượng virus tái hồi độc lực sau một số lần cấy chuyển. Tương tự, sau khi chủng vacxin, virus có thể được bài thải từ cá thể nhận vacxin trong khoảng 3-4 ngày. Điều này là nguyên nhân virus phát hiện ở gà có nguồn gốc vacxin tới tận 5 tuần sau khi sử chủng ngừa bằng vacxin nhược độc aMPV cảở aMPV/A và B (Naylor C. & cs., 1997a; Ongor & cs., 2010). Catelli Elena & cs. (2006) phát hiện virus vacxin aMPV/A đã xảy ra đột biến tại 9 nt và làm thay đổi 3 aa. Trong đó aa tại vị trí 3825 liên quan thay thế bởi Glutamic acid bằng một Lysin của gen F, đã tạo ra chủng virus có độc lực, có khả năng gây ra các triệu chứng tương đương chủng cường độc. Các chủng thực địa có thể tiến hóa để trốn tránh tác động của kháng thể do vacxin subtype tương đồng sinh ra (Catelli Elena & cs., 2010).
aMPV/C chủ yếu phát hiện thấy ở gà tây tại Hoa Kỳ (Cook Jane Ka & cs., 1999; Toquin D. & cs., 2000); Subtype C cũng gây bệnh trên ngan, vịt trắng Bắc Kinh bố mẹ tại Pháp (Toquin D & cs., 1999). aMPV/C gây bệnh ở gà nhà chỉ mới được báo cáo tại Trung Quốc ở gà thịt trong giai đoạn từ 20-60 ngày tuổi (Wei & cs., 2013). Chủng aMPV/C tại Trung Quốc này có độ tương đồng rất cao (78,5%) với hMPV chủng BJ1816 gây bệnh trên người tại Trung Quốc. Thêm vào đó, khi so sánh các aMPV/C khác với virus aMPV/C phân lập trên gà thịt tại
Trung Quốc cho thấy mức độ tương đồng thấp hơn (96,0%–96,7%) tỷ lệ tương đồng bình thường giữa các nhóm aMPV/C (98,3%– 99,0%).
Tương tự, aMPV/D chỉ được phát hiện ở gà tây tại Pháp từ năm 1985 (Bayon-Auboyer & cs., 1999; Bäyon-Auboyer & cs., 2000). Chưa từng ghi nhận aMPV/D gây bệnh trong tự nhiên ở gà nhà mặc dầu có thể thấy hiện tượng chuyển huyết thanh ở gà nhà khi công cường độc trong điều kiện thí nghiệm mặc dù không phát hiện được virus hay triệu chứng (Brown Paul A. & cs., 2014; Brown P. A. & cs., 2019).
PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
3.1.1. Địa bàn lấy mẫu nghiên cứu
Các mẫu huyết thanh và bệnh phẩm được thu thập ở các trang trại chăn nuôi gà tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam.
3.1.2. Nơi thực hiện các kỹ thuật phòng thí nghiệm
Phòng thí nghiệm bộ môn Vi Sinh Vật – Truyền nhiễm, khoa Thú y, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam.
Phòng thí nghiệm Trung tâm chẩn đoán Thú y Greenlab, Công ty CP Medion Việt Nam.
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Đề tài thực hiện từ tháng 8/2019-4/2020.
3.3. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu huyết thanh từ gà ≥3 tuần tuổi, chưa từng chủng vacxin aMPV, nuôi tại các tỉnh khu vực miền Bắc;
- Virus aMPV trong các mẫu bệnh phẩm gà được chẩn đoán lâm sàng do aMPV gây ra.
3.3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.3.2.1. Các loại hóa chất sử dụng
- Các loại hoá chất, môi trường dùng cho các phản ứng huyết thanh học và phản ứng RT-PCR được chuẩn hóa theo quy trình nghiên cứu của Phòng thí nghiệm bộ môn Vi Sinh Vật – Truyền nhiễm, khoa Thú y -Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam và Phòng thí nghiệm Trung tâm chẩn đoán thú y Greenlab, Công ty CP Medion Việt Nam.
Sinh phẩm, hóa chất dùng cho phản ứng RT- PCR: (i) Trizol™ Reagent (15596026, Invitrogen); Chloroform (102445, Merck Millipore); 2-propanol (109634, Merck Millipore); Ethanol 75%; nước 3D (Deionized Double Distilled Water); (ii) Random hexamers (N8080127, Invitrogen); kit M-MLV Reverse
Transcriptase (28025013, Invitrogen); (iii) Kit MaximeTM PCR PreMix (i-Taq) (25025, INTRON Biotechnology, Hàn Quốc); (iv) Dung dịch nhuộm RedsafeTM Nucleic Acid Staining Solution (21141, INTRON Biotechnology, Hàn Quốc); cặp mồi đặc hiệu gen G (kích thước 451bp) của virus theo nghiên cứu đã công bố (Bayon-Auboyer & cs., 1999; Bäyon-Auboyer & cs., 2000), chi tiết xem bảng 3.1.
3.3.2.2. Thiết bị và dụng cụ sử dụng
- Dụng cụ mổ khám gia cầm gồm: kéo (kéo cắt da, cơ và cắt xương), kẹp... - Dụng cụ lấy mẫu xét nghiệm: syringe, tăm bông vô trùng, dao vô trùng cắt bệnh phẩm, túi plastic vô trùng đựng bệnh phẩm, túi chứa formol 10%, thùng đá