Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Điều tra thành phần bệnh nấm hại trên cây gừng và nghệ + Thu thập mẫu bệnh
+ Xác định nguyên nhân gây bệnh + Lây nhiễm nhân tạo
+ Xác định danh tính nấm gây bệnh dựa vào hình thái và kỹ thuật phân tử - Điều tra mức độ gây hại, quy luật phát sinh phát triển của bệnh.
- Thử nghiệm hiệu lực của vi khuẩn đối kháng và thuốc hóa học đối với nấm gây bệnh trong điều kiện invitro.
- Thử nghiệm hiệu lực của thuốc hóa học đối với nấm bệnh trên đồng ruộng.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp điều tra thành phần bệnh hại Phương pháp thu mẫu
Tiến hành thu thập mẫu bệnh ở các địa điểm điều tra, ghi nhận, thu thập tất cả các triệu chứng liên quan đến bệnh hại trên tất cả các bộ phận của cây. Các mẫu bệnh thu thập được giữ trong túi giấy báo hoặc túi xi măng, có ghi rõ dạng triệu chứng, bộ phận bị bệnh, nguồn cây giống, tuổi cây, điều kiện đất đai địa phương thu thập, ngày điều tra. Sau khi thu thập mẫu được mang về phòng thí nghiệm để phân lập, giám định ngay hoặc được bảo quản trong tủ lạnh.
Phương pháp xác định nguyên nhân gây bệnh
Mô tả triệu chứng bệnh, so sánh với các tài liệu đã được công bố
Quan sát trực tiếp nấm gây bệnh dưới kính hiển vi
Phân lập trực tiếp nấm gây bệnh từ mẫu bệnh.
+ Cắt mô bệnh thành những miếng có kích thước 1×1cm. Miếng cắt phải có cả mô bệnh và mô khỏe. Khử trùng bề mặt bằng cồn 700 trong 15 – 20 giây, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng.
+ Thấm khô miếng cắt bằng giấy thấm vô trùng, dùng dao đã khử trùng cắt mô bệnh thành các miếng cắt nhỏ 5×5mm
+ Đặt các mảnh mô cây vào môi trường nghèo dinh dưỡng (WA, CA) + Khi nấm đã phát triển với đường kính tản nấm khoảng 4-5cm, lấy phần đỉnh sinh trưởng của sợi nấm cấy truyền sang môi trường thích hợp như PDA, CMA, CLA, SPA.
+ Theo dõi sự phát triển của các vi sinh vật, quan sát các vi sinh vật gây bệnh dưới kính hiển vi.
+ Xác định tên nấm gây bệnh theo tài liệu nước ngoài.
Phương pháp bẫy Phytophthrora và Pythium : Bẫy đất
• Bẫy nấm từ đất bằng táo hoặc bầu
1. Lau táo (bầu) với cồn.
2. Dùng một cái khoan nút chai sạch cắt một lỗ có đường kính khoảng 10 mm từ một bên tới lõi.
3. Bỏ đất đầy lỗ và dán lỗ bằng một miếng băng dính để đất khỏi rơi ra ngoài. 4. Đặt táo (bầu) ở nhiệt độ phòng có ánh sáng.
5. Phân lập nấm sau 1-3 ngày từ phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh màu nâu lan ra từ phần đất bẫy.
• Bẫy từ dung dịch đất bằng lá và cánh hoa
Các loài Phytophthora và Pythium có thể được phân lập từ đất bằng cách thả nổi lá hoặc cánh hoa hồng sạch trên dung dịch đất bẫy. Nếu có các loài này trong đất, du động bào tử được hình thành di chuyển lên phía trên và xâm nhiễm vào lá hoặc cánh hoa. Đây là phương pháp chọn lọc bởi vì nó thích hợp cho việc phân lập các loài sản sinh ra du động bào tử.
1. Cho khoảng 100g đất vào một cốc nhựa.
2. Đổ nước vô trùng hoặc nước cất vào cốc sao cho ngập đất khoảng 5- 10cm.
3. Thả vào cốc những mẩu bộ phận tươi của cây trồng mẫn cảm với bệnh, các vật liệu bẫy này sẽ nổi trên mặt nước.
4. Đặt cốc nguyên vị trí trong vòng 2-4 ngày.
5. Phân lập nấm sau 2-3 ngày từ mép vết bệnh đã phát triển trên vật liệu bẫy sau khi rửa trong nước vô trùng và khử trùng bề mặt, dùng môi trường chọn lọc (như PSM).
Vật liệu bẫy cũng có thể là các loại cây trồng ký chủ của Phytophthora
hoặc Pythium. Vật liệu có thể dùng để bẫy bao gồm lá ớt, cánh hoa hồng, lá cây có múi, cây con ớt, đậu lupin và đậu tương. Nếu bẫy không tự nổi được, có thể treo bẫy lên nắp cốc sao cho bẫy lơ lửng ở mặt nước hoặc gắn vào một miếng xốp hay một vật liệu nổi thích hợp (Burgess et al., 2009).
Phương pháp đếm bào tử bằng buồng đếm hồng cầu
Buồng đếm hồng cầu thường là một phiến kính dày 2 - 3 mm có một vùng đĩa đếm nằm giữa phiến kính và được bao quanh bởi một rãnh. Đĩa đếm thấp hơn bề mặt của phiến kính khoảng 1/10 mm, có hình tròn vì thế khi được phủ lên bằng một lá kính thì độ sâu của đĩa đếm sẽ đồng đều nhau. Vùng đĩa đếm có diện tích 1mm2 và được chia thành 25 ô vuông lớn có diện tích mỗi ô là 1/25 mm2 và 400 ô vuông nhỏ hơn, mỗi ô có diện tích 1/400 mm2.
Khi thực hiện quan sát và đế m vi sinh vật, cho thêm vài giọt formalin vào trong mẫu, trộn đều. Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 - 10 tế bào vi sinh vật. Để đạt được độ pha loãng như vậy cần phải ước lượng được số lượng vi sinh vật trong mẫu, đồng thời phải thử vài lần trong quá trình pha loãng. Mẫu phải được pha loãng bằng dung dịch pha loãng chứa 0,1% pepton và 0,1% laurylsulphate và 0,01% methylblue. Tất cả các dung dịch pha loãng đều cần phải được lọc trước khi sử dụng. Đặt một giọt mẫu được pha loãng vào vùng đếm trên buồng đếm ở khu vực buồng đếm. Chỉnh thị trường sao cho một thị trường chứa trọn một ô lớn (4 x 4 = 16 ô nhỏ). Đếm số tế bào hiện diện trong 1 ô lớn. Sau đó, chỉnh thị trường tìm 1ô lớn khác. Đếm số tế bào của ít nhất 5 ô lớn. Lấy trị số trung bình. Cách tính mật độ tế bào như sau: thể tích của một ô lớn là 1/25mm2 x 1/10m = 1/250mm3 hay 1/250 x 103 cm3 = 4 x 106 ml. Như vậy, mật độ tế bào của huyền phù mẫu là: N/ml = 0,25a x 106 tế bào/ml (trong đó a là số tế bào bình quân trong một ô lớn.
Phương pháp lây nhiễm nhân tạo
Đối với nấm hại rễ, cổ rễ gây nhiễm nấm vào đất.
Tiến hành lây nhiễm từng loại nấm gây bệnh lên thân, gốc cây cần lây nhiễm. Số lượng cây lây nhiễm với mỗi loại nấm là 10 đến 20 cây. Công thức đối chứng là không lây bệnh. Quan sát sự phát triển của vết bệnh sau các ngày lây nhiễm. Tính tỷ lệ bệnh (%).
- Cách lây nhiễm:
+ Đối với nấm Fusarium sp.: Tạo nguồn bào tử lây nhiễm bằng cách cạo toàn bộ sợi nấm đã được cấy đơn bào tử trên môi trường CLA từ 5-7 ngày vào cốc chứa 10ml nước cất, lắc nhẹ để bào tử nấm phân tán vào nước. Sau đó nhúng rễ cây vào dịch chứa bào tử nấm Fusarium để bào tử có thể bám trực tiếp trên rễ, nảy mầm xâm nhập vào trong cây. Giữ ẩm cho cây hàng ngày để tạo điều kiện thuận lợi cho bào tử nảy mầm. Quan sát sự xâm nhiễm của nấm trên cây.
+ Đối với Pythium sp.: Bới nhẹ gốc cây cần lây nhiễm, sau đó đặt 2-3 miếng thạch có chứa nấm được cắt ra từ tản nấm đang sinh trưởng 3-4 ngày trên môi trường PDA. Tưới nước hàng ngày cho cây để tạo điều kiện đủ ẩm để nấm sinh bọc bào tử và du động bào tử xâm nhập vào trong cây. Quan sát sự xâm nhiễm của nấm trên cây.
- Quan sát sự phát triển của vết bệnh sau các ngày lây nhiễm. Tính tỷ lệ bệnh (%).
Phương pháp bảo quản mẫu nấm bệnh:
Bảo quản trong tuýp nhựa
- Đối với nấm Phytophthora và Pythium: nấm cấy trên môi trường PCA khoảng 5 ngày, sau đó cắt từng miếng thạch hình vuông khoảng 5×5mm, cho vào tuýp nước cất vô trùng, đóng kín nắp và giữ ở nhiệt độ phòng (Nguyễn Kim Vân và cs., 2001).
- Đối với nấm Fusarium: đổ môi trường CLA vào ống tuýp nhỏ, sau đó cấy truyền nấm, đợi nấm mọc kín tuýp rồi cất trong tủ lạnh 40C (Nguyễn Kim Vân và cs, 2001).
Phương pháp xác định danh tính nấm dựa vào hình thái
Các chỉ tiêu hình thái được xác định: đối với nấm Fusarium sp. dựa theo Burgess et al. (1994), đối với Phytopthora sp. dựa theo Donalt et al. (2005).
Phương pháp xác định loài trên mẫu nấm đã phân lập bằng kỹ thuật PCR Chiết DNA từ mẫu nấm
- Chiết bằng phương pháp CTAB
+ Ủ đệm CTAB + βME (100µl 2 mecarto-ethanol + 10ml CTAB ) ở 650C trong 30’.
+ Cho sợi nấm thuần từ tản nấm cấy trên môi trường PDA sau 3 ngày vào tube 1.5 ml.
+ Cho vào tube khoảng 200 µl CTAB + βME để nghiền nát bằng chày nhựa rồi thêm 800 µl CTAB + βME.
+ Ủ tube trong bình ổn nhiệt ở nhiệt độ 60-65oC trong 20-30’. + Ly tâm 10-15’.
+ Lấy dịch trên kết tủa.
+ Cho 1 thể tích dung dịch chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) tương đương dịch trong tube.
+ Ly tâm 10-15’.
+ Chiết lần 2 với Chloroform : isoamyl alcohol (24 :1). Để lạnh ở ngăn đá 5’. + Ly tâm trong 10-15’.
+ Lấy dịch trên tủa cho vào tube 1,5ml.
+ Bổ sung một thể tích tương đương isopropanol lạnh. Để ở nhiệt độ -200C trong 10’.
+ Lắc đều, ly tâm trong 20-25’.
+ Loại bỏ dịch trên tủa, giữ lại cặn spin trong 1 giây để hút hết dịch trong tube ra.
+ Rửa cặn DNA 2 lần với ethanol 70%. + Làm khô cặn bằng không khí.
+ Hòa cặn DNA với 20-25µl TE, búng nhẹ để DNA tan hết, bảo quản tube ở điều kiện nhiệt độ -200C.
Phản ứng PCR
Các phản ứng PCR được thực hiện trong ống eppendopt 0,5 ml với tổng thể tích phản ứng 25 μl dùng cặp mồi ITS4 và ITS5 với thành phần của mỗi phản ứng PCR như sau:
H2O 19,5µl Buffer (Dream Taq) 2,5µl
dNTPs 0,5µl mồi ITS4 0,5µl Mồi ITS5 0,5µl Taq (Dream) 0,5µl DNA 1µl Tổng thể tích 25µl Điều kiện phản ứng PCR: 94oC 4 phút x 1 94 oC 50 oC 72 oC 40 giây 35 giây 1 phút x 35 72 oC 5 phút x 1 24oC 30 phút x 1 Điện di agarose - Chuẩn bị
+ Pha đệm điện di 1x TAE từ dung dịch gốc 5x TAE: lấy 100ml 5x TAE cho vào cốc đong, bổ sung 400ml nước cất lắc đều.
+ Chuẩn bị bản gel : cân 1g agarose, cho vào 100ml 1x TAE sau đó lắc nhẹ lọ để hòa tan agarose. Sau khi agarose đã tan hoàn toàn đun trong lò vi sóng 3-4’ bổ sung Ethidium Bromide theo tỉ lệ cứ 100ml dung dịch gel cho 4µl lắc đều để lọ ở nhiệt độ phòng.
+ Khi dung dịch agarose 1% nằm trong khoảng 500C thì đổ vào khuôn có đặt lược tạo giếng. Để bản gel ở nhiệt độ phòng 30 phút.
+ Lấy các tube 0.5ml chứa các sản phẩm PCR đánh số thứ tự cho vào mỗi tube 4µl 6X loading Dye, đảo đều và spin trong 5 giây.
- Tiến hành
+ Sau 30 giây để khuôn ở nhiệt độ phòng thì tiến hành rút lược
+ Đặt cả khay khuôn gel vào bể điện di, đổ dung dịch đệm 1x TAE phủ ngập gel.
+ Nhỏ mẫu vào giếng : dùng pipet hút 7-10µl dung dịch mẫu cần chẩn đoán cho vào mỗi giếng theo thứ tự. Ngoài các mẫu chạy PCR còn nhỏ thêm 1 giếng marker làm chuẩn.
+ Cắm nguồn điện cho máy điện di. Đặt ở hiệu điện thế 100V trong 25 phút, tắt máy điện di, đặt bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại. Quan sát các vệt DNA hiện lên và chụp ảnh.
Giải trình tự vùng ITS
Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Sản phẩm PCR tinh chiết được giải trình tự trực tiếp bằng mồi PCR (ITS4)
Phân tích trình tự:
Các chuỗi mẫu được xác định danh tính khi so sánh với các chuỗi đã công bố từ trước nhờ phần mềm tìm kiếm BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
3.4.2. Phương pháp điều tra mức độ gây hại, quy luật phát sinh phát triển của bệnh
Phương pháp điều tra bệnh hại được tiến hành theo “Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng” (Viện BVTV,1997).
- Để xác định thành phần bệnh hại, tiến hành quan sát các triệu chứng trên toàn bộ cây trồng điều tra ở các diện tích sản xuất. Phát hiện các loại bệnh hại và thu thập mẫu đưa về phòng thí nghiệm để phân loại, giám định.
- Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh được tính theo công thức: TLB (%) = TLB (%) = × 100
A: Tổng số cây bị bệnh; B: Tổng số cây điều tra
Xác định mức độ phổ biến của bệnh theo thang 4 cấp sau (Viện BVTV,1997).
+: rất ít phổ biến (< 10% cây hoặc lá bị bệnh) ++: Ít phổ biến (11 – 25% cây hoặc lá bị bệnh) +++: Phổ biến (26 – 50% cây hoặc lá bị bệnh) ++++: Rất phổ biến (> 50% cây hoặc lá bị bệnh)
3.4.3. Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn đối kháng với nấm gây bệnh
Mỗi một vi sinh vật đối kháng lần lượt được cấy thử nghiệm với nấm gây bệnh, với khoảng cách giữa chúng là 3cm, cách mép đĩa 1 – 1,5cm. Mỗi công thức được nhắc lại 3 lần. Đối chứng được cấy trên môi trường PGA. Sau đó đặt các đĩa trong tủ định ôn ở nhiệt độ 28oC, nếu xuất hiện những vùng ức chế (vòng vô khuẩn – với thử nghiệm là vi khuẩn đối kháng), nghĩa là có sự đối kháng tại điểm đó. Dựa vào kích thước vòng ức chế (D - d, mm) để đánh giá hiệu lực đối kháng của chúng. Trong đó D là đường kính tản nấm gây bệnh ở công thức đối chứng, d là đường kính tản nấm gây bệnh ở công thức thí nghiệm. Đánh giá sự đối kháng sau 7-10 ngày nuôi cấy.
Hiệu lực đối kháng (%) = ×100
Kiểm tra tính kháng: Lấy 1 mm3 vùng ức chế của vi khuẩn và nấm đối kháng, cấy ruyền sang đĩa petri có chứa môi trường PGA, đặt trong tủ định ôn ở 26oC trong 7 ngày. Theo dõi sự phát triển của nấm gây bệnh, nếu nấm không phát triển lại, chứng tỏ vi khuẩn đối kháng có khả năng kháng nấm hoàn toàn.
3.4.4. Đánh giá hiệu lực của một số loại thuốc hóa học trên môi trường nhân tạo
Thuốc dạng bột được pha với nước cất vô trùng sau đó cho vào môi trường PDA ở các nồng độ khuyến cáo (=1), loãng gấp 2 lần so với khuyến cáo, đặc gấp 2 lần so với khuyến cáo. Thuốc được cho vào môi trường PDA (đã hấp khử trùng và để nguội 55oC) ở các nồng độ thuốc xác định và được rót ra đĩa petri (loại đĩa 9 cm). Các viên môi trường PDA (Đường kính 4 mm) được lấy tại mép tản nấm đang phát triển (Khoảng 2 ngày) được đặt vào giữa đĩa môi trường có chứa thuốc. Mỗi thí nghiệm gồm ba đĩa (3 lần nhắc lại). Đối chứng là các đĩa môi trường không chứa thuốc. Các đĩa môi trường để ở 30oC trong tối. Sau 3 ngày đo 2 đường kính tản nấm (vuông góc với nhau) của mỗi đĩa. Hiệu lực thuốc được tính theo công thức Abbott:
H = (C – T) x 100 /C Trong đó:
H (%): Là hiệu lực của thuốc tính theo phần trăm C: Kích thước tản nấm trong công thức đối chứng T: Kích thước tản nấm trong các công thức thí nghiệm
3.4.5. Đánh giá hiệu lực của một số loại thuốc trừ nấm trên bệnh thối gốc rễ nghệ ngoài đồng ruộng Hàng bảo vệ H àn g bả o vệ CT1 CT2 CT3 CT4 H àn g bả o vệ CT4 CT1 CT3 CT2 CT2 CT1 CT4 CT3 Hàng bảo vệ
- CT1: Thuốc mataxyl 500 WP (hoạt chất metalaxyl): phun vào gốc khi điều tra phát hiện bệnh trên đồng ruộng với nồng độ 40g / 1000m2.
- CT2: Thuốc Tachigaren 30L (hoạt chất hymexazon): phun vào gốc khi điều tra phát hiện bệnh trên đồng ruộng với nồng độ 30ml/20lít, lượng nước thuốc 200-300 lít/1000m2.
- CT3: Thuốc Ridomil gold 68 WG (hoạt chất metalaxyl, mancozeb) phun vào gốc với nồng độ 40g/1000m2.
- CT4: đối chứng, phun nước lã.
Theo dõi tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh trước khi phun thuốc, sau khi phun thuốc 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần, 4 tuần, hiệu lực thuốc, hiệu quả phòng trừ ngoài đồng ruộng và năng suất các công thức sau khi thu hoạch.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. THÀNH PHẦN BỆNH HẠI TRÊN NGHỆ VÀ GỪNG TẠI HÀ NỘI VÀ PHỤ CẬN NĂM 2016
4.1.1. Thành phần bệnh hại trên cây nghệ tại Quảng Ninh, Hưng Yên và