4.2.4. Xác định 2 loài Pythium Py1 và Py2 bằng giải trình tự vùng ITS
4.2.4 .1. PCR và giải trình tự 2 loài Pythium Py1 và Py2
Để xác định chính xác danh tính loài, 3 mẫu Pythium thuộc 2 loài Py1 và Py2 thuần phân lập từ cây nghệ bệnh tại Hưng Yên năm 2017 được chiết DNA, thực hiện PCR dùng cặp mồi ITS4 và ITS5. Sản phẩm PCR có kích thước 0.8 kb giống như của các nấm trứng Oomycetes (Hình 4.10).
Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose và được giải trình tự 1 chiều bằng mồi PCR (ITS4). Kết quả giải trình tự cho thấy chỉ 2 mẫu Py1 và Py2a có chất lượng tốt với trình tự đoạn được được có độ dài lần lượt là 842 và 813 bp (Bảng 4.10).
Bảng 4.10. Kết quả giải trình tự 3 mẫu nấm Pythium gây bệnh thối gốc rễ tại Khoái Châu – Hưng Yên năm 2017
Mẫu Mã sequencing Nguồn Chất lượng trình tự Trình tự đọc được (bp)
Py1 3A Pythium phân lập từ
bẫy bầu Tốt 842
Py2a 1A Pythium phân lập từ rễ Tốt 813 Py2b 2A Pythium phân lập từ
bẫy hoa hồng Nhiễu 0
>Py1 (3A) AAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCACACCATAAAAACTTTCCACG TGAACCGTTGAAATCATGTTCTGTGCTCTCTTTCGGGAGGGCTGAACGAAGGTGGGCTGCTTAATTGTA GTCTGCCGATGTATTTTTCAAACCCATCTACCTAATACTGATCTATACTCCAAAAACGAAAGTTTATGGTT TTAATCTATAACAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCG ATACGTAATGCGAATTGCAGAATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCACATTGCACTTTCGGGTTA TGCCTGGAAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGCCTTTCTTTTTCTGTGTAGTCAGGGAG AGAAATGGCAGAATGTGAGGTGTCTCGCTGGCTCCCTTTTCGGAGGAGAAGACGCGAGTCCCTTTAAA TGTACGTTCGCTCTTTCTTGTGTCTAAGATGAAGTGTGATTCTCGAATCGCGGTGATCTGTTTGGATCGC TTTGCGCATTTGGGCGACTTCGGTTAGGACATTAAAGGAAGCAACCTCTATTGGCGGTATGTTAGGCTT CGGCCCGACGTTGCAGCTGACGGAGTGTGGTTTTCTGTTCTTTCCTTGAGGTGTACCTGAATTGTGTGA GGCAATGGTCTGGGCAAATGGTTGCTGTGTAGTAGGGTTTTGCTGCTCTTGGACGCCCTGTTTTCGGAT AGGGTAAAGGAGGCAACACCAATTTGGGACTGTTTGCAATTTATTGTGGACAACTTTCTAATTGGACCT GATATCAGGTA >Py2b (1A) AACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCACACCTAAAAACATCTTTCCACGTGAAC CGTTTGTGACATGGTTGGGCTTGTGCGCGTTCTCTCTGTTTTGGGGGGAGGCGTGCGAGCTATCTGTAA ACTTGTCAAACCCATTCTCTTTGATAACTGAAACATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTGAACTAGA
TAGCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTA ATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTTCGGGTTATCCCTGG AAGTATGTCTGTATCAGTGTCCGTACACTAAACTTCCCTCCTTTGCGTCGTGTAGTCGGCGCGTTGGAAA TTGTGGCAGATGTGAGGTGTCTTGATTGTTGTGTCTTTTTTGATGCGTCGGTCAAGTCCCTTGAAAGTCG GACGCGTATCTTTGCGTGCGTTGGGTGCCGGTGGGCTGTGGGACGCGTCTGTTGACGAGTCTGGCGAC CTTTGGCGCGTGCATGCTTGGGCACTGTGTATTGGCGGTATGTTAGGCTGCGTTCGCGCGGCTTTGACA ATGCAGCTGATGCGTGTGTTTGGGCTGTGGTGCTGTATGGGTGAACCGGATGGTCGATGGGTTTTATA TGCGTTTCTCGTGTCTGTTTTTATCCGGTGTTCTGTATCGTGCGTGGAGTGTGTCATCATTTGGGAATTT GTACGTCTTCTTGTTTTGAGGGCGTATCTCATTTGGACCTGATATCAGACAAG
Hình 4.12. PCR nhân vùng ITS của mẫu Pythium Py1 và Py2 phân lập từ cây nghệ bệnh thối gốc rễ thu tại Khoái Châu – Hưng Yên năm 2017. M là
thang DNA (GeneRuler 100 bp, Thermo Scientific) với băng tham khảo được ghi rõ bằng mũi tên. Py2a và Py2b đều là loài Py2 được phân lập từ
bẫy hoa hồng và rễ nghệ
4.2.4 .2. Xác định loài Py1 và Py2 bằng so sánh với trình tự trên GenBank
Tìm kiếm trình tự tương đồng đã được thực hiện bằng phần mềm tìm kiếm trực tuyến (Blast search) dùng trình tự đọc được của 2 mẫu Py1 và Py2b làm chuỗi hỏi (query). Kết quả tìm kiếm được trình bày ở Bảng 4.11.
Kết quả tìm kiếm đã cho thấy tất cả các mẫu trên Ngân hàng gen gần gũi nhất với mẫu Py1 là loài Pythium aphanidermatum với mức đồng nhất trình tự của đoạn so sánh đều 99%, tất cả các mẫu trên Ngân hàng gen gần gũi nhất với mẫu Py2b là loài Phytopythium helicoides (syn. Pythium helicoides) với mức đồng nhất trình tự của đoạn so sánh đều 99%,
Dựa trên kết quả tìm kiếm trên Ngân hàng Gen, chúng tôi kết luận 2 mẫu
aphanidermatum (mẫu Py1) và Phytopythium helicoides (mẫu Py2). Kết quả định danh phân tử này cũng thống nhất với các đặc điểm hình thái được quan sát thấy ở phần trên.
Bảng 4.12. Kết quả tìm kiếm trên Ngân hàng gen (GeneBank) dựa trên trình tự ITS của 2 mẫu Py1 và Py2
Mẫu Loài GenBank gần gũi nhất Genbank Mã
Phần trăm đoạn so sánh (%) Mức đồng nhất trình tự (%) Py1
Pythium aphanidermatum, strain
CBS 118.80, AY598622 100 99
Pythium aphanidermatum, strain
UOP390 AB355599 99 99
Pythium aphanidermatum, isolate C-
SDSO2 KU211462 99 99
Py2b
PhytoPythium helicoides, isolate
GDGJ6 KT750954 100 99
PhytoPythium helicoides, strain CBS
286.31 AY598665 100 99
Pythium helicoides, isolate 186PC HQ237484 98 99 Ghi chú: Chỉ trình bày 3 mẫu GeneBank gần gũi nhất
Như vậy, dựa trên phân tích hình thái, phân tử và lây nhiễm nhân tạo, hai loài Pythium/Phytopythium nữa đã được xác định gây bệnh trên cây nghệ tại Việt Nam.
Phytopythium helicoides thuộc một chi mới, Phytopythium, được tạo ra bởi các loài Pythium thuộc nhóm K, có đặc điểm phân tử và hình thái trung gian giữa Pythium (hình thành động bào tử trong bóng –vesicle) và
Phytophthora (bọc bào tử hình cầu, hình trứng, có núm, hình thành theo kiểu nội sinh từ bọc bào tử đã giải phóng động bào tử - internal proliferation) (Bala
et al., 2010; de Cock et al. 2015).
Phytopythium helicoides là một tác nhân gây bệnh cây và đã được công bố gây thối gốc rễ trên rất nhiều loài cây như thược dược, cây họ bầu bí, họ đậu, họ cà, mía, hướng dương, hoa và cây cảnh (van der Plaats-Niterink, 1981). Gần đây hơn, loài này cũng được công bố gây hại trên cây quả Kiwi ở Nhật Bản và Trung Quốc (Shimizu et al., 2005; Wang et al., 2015), gây thối rễ cây Tibouchina
semidecandra ở Đài Loan (Huang, 2009), thối rễ hoa hồng tại Nhật Bản (Kagayama, 2002), cây thu hải đường tại Trung Quốc (Yang et al., 2013), cây sen tại Trung Quốc (Yin et al., 2016), thối thân cây quất tại Trung Quốc (Chen et al., 2016)
Tại Việt Nam, Phytopythium helicoides cũng đã được công bố gây hại trên một số cây trồng như thối nõn cây mạch môn (Nguyễn Thế Hinh, 2014), thối rễ cây vú sữa (Nguyễn Thành Hiếu và cs., 2012), thối gốc/thân cây hồng hoa (Hà Viết Cường và cs., 2016).
Loài Pythium aphanidermatum có phân bố khắp thế giới và phổ ký chủ rất rộng, gây bệnh trên ít nhất 62 loài cây thuộc 25 họ thực vật một và 2 lá mầm kể cả cây nghệ (van der Plaats-Niterink, 1981; CABI, 2017).
Tại Việt Nam, loài Pythium aphanidermatum mới chỉ được công bố gây hại trên cây hoa cúc tại Quảng Nam và Huế (Luong et al., 2010).
4.2.5. Sự phát sinh phát triển của bệnh thối gốc rễ trên nghệ tại Hưng Yên năm 2017
Để tìm hiểu quy luật phát sinh, phát triển của bệnh thối gốc rễ gây hại trên cây nghệ, chúng tôi đã định kỳ điều tra diễn biến bệnh trên đồng ruộng tại xã Chí Tân – Khoái Châu – Hưng Yên từ tháng 4 khi bệnh xuất hiện, kết quả tỷ lệ bệnh được thể hiện ở bảng 4.12.
Bảng 4.12. Diễn biến bệnh thối gốc rễ nghệ tại Chí Tân – Khoái Châu – Hưng Yên năm 2017
Ngày điều tra Thời kỳ sinh trưởng Tỷ lệ cây nhiễm bệnh
(%) 11/04/2017 Cây con 1.60 21/04/2017 Cây 2-3 lá 3.20 01/05/2017 Cây 3-4 lá 8.20 11/05/2017 Đẻ nhánh 14.00 21/05/2017 Đẻ nhánh mạnh 16.40
02/06/2017 Đâm tia tạo củ 19.20
12/06/2017 Củ non 20.80
22/06/2017 Phát triển củ 23.60
Qua theo dõi diễn biến bệnh cho thấy, bệnh thối gốc rễ trên nghệ xuất hiện từ giai đoạn cây con cho đến khi thu hoạch. Tỷ lệ bệnh tăng dần theo thời gian sinh trưởng của cây. Ở giai đoạn cây con (vào trung tuần tháng Tư), tỷ lệ bệnh thấp, 1.6 %. Vào gia đoạn phát triển củ (cuối tháng Sáu, đầu tháng Bảy), tỷ lệ bệnh khá cao, 25%. Giai đoạn này có nhiều mưa, nhiệt độ cao, phù hợp cho sự phát triển của bệnh.
4.2.6. Ảnh hưởng của mật độ trồng đến bệnh thối gốc rễ trên nghệ tại Hưng Yên năm 2017
Pythium tồn tại trong đất và gây hại bộ phận dưới mặt đất của nghệ và liên quan chặt chẽ đến độ ẩm của đất. Pythium dễ phát sinh và lây nhiễm truyền lan khi độ ẩm trong đất cao do đó vấn đề mật độ trồng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển bệnh. Do vậy, để góp phần xây dựng được quy trình phòng trừ tổng hợp bệnh trên nghệ chúng tôi cũng tiến hành bố trí thí nghiệm đánh giá mật độ, khoảng cách trồng đền sự phát sinh phát triển của bệnh. Thí nghiệm được bố trí với 3 khoảng cách trồng khác nhau 35 x 30 cm (khoảng cách trồng theo người dân); 35 x 40 cm và 35 x 50 cm. Thí nghiệm được đánh giá thông qua tỷ lệ bệnh sau 2 tháng, 4 tháng, 6 tháng, 8 tháng sau khi trồng. Kết quả thí nghiệm được thể hiện tại bảng 4.13.
Bảng 4.13.Ảnh hưởng của mật độ trồng đến bệnh thối gốc rễ trên nghệ tại Hưng Yên Khoảng cách trồng (cm) Số cây theo dõi Tỷ lệ bệnh (%) Sau 2 tháng trồng Sau 4 tháng trồng Sau 6 tháng trồng Sau 8 tháng trồng 35 x 30 90 3,7 7,4 18,8 37,0 35 x 40 60 6,1 11,1 27,2 32,2 35 x 50 50 6,7 17,3 28,0 31,3
Qua bảng thấy, khoảng cách trồng nghệ ở cả 3 công thức thí nghiệm đều ảnh hưởng như nhau đến bệnh thối gốc rễ do nấm Pythium spp. gây ra. Sau 2 tháng trồng tỷ lệ bệnh thối gốc rễ là 3,7 % ở khoảng cách 30 x 30 cm, 6,1% ở khoảng cách 35 x 40 cm và 6,7% ở khoảng cách 35 x 50 cm. Bệnh phát sinh phát triển tăng dần ở cả 3 khoảng cách trồng. Đến thời điểm tháng 12 trước khi thu hoạch một tháng chúng tôi điều tra, tỷ lệ bệnh ở các công thức này tương đối cao
lần lượt là 22,7%; 16,9% và 18,0% và cả 3 công thức này cũng khác nhau không có ý nghĩa.
Như vậy mật độ trồng nghệ mà chúng tôi đã thử nghiệm chưa thể kết luận có ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ bệnh thối rễ do Pythium spp. trên đồng ruộng, tuy nhiên trồng nghệ với khoảng cách 35 x 40 cm thì tỷ lệ bệnh thối rễ cũng thấp hơn so với các khoảng cách 35 x 30.
4.2.7. Ảnh hưởng của thời vụ trồng đến bệnh thối gốc rễ trên nghệ tại Hưng Yên năm 2017
Để đánh giá ảnh hưởng của thời vụ trồng nghệ đến sự phát sinh phát triển của bệnh thối gốc rễ nghệ do Pythium spp. gây ra chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm 3 thời vụ trồng nghệ khác nhau, thời vụ thứ nhất được trồng vào giữa tháng 3, do củ nghệ có thời gian ngủ trước khi mọc mầm trong khoảng từ 20 – 30/4 hàng năm nên thời vụ thứ 2 chúng tôi bố trí sau đó 15 ngày là vào đầu tháng 4 và thời vụ thứ 3 vào cuối tháng 4 trước khi nghệ bước vào giai đoạn mọc mầm để đánh giá thời gian ngủ của củ giống dưới đất ảnh hưởng đến hai bệnh này.
Để đánh giá ảnh hưởng của bệnh thối gốc rễ do Pythium spp. chúng tôi cũng tiến hành điều tra đánh giá tỷ lệ bệnh thối gốc rễ sau khi trồng 60 ngày, 120 ngày, 180 ngày và 240 ngày sau trồng. Kết quả đánh giá được thể hiện tại bảng 4.14.
Bảng 4.14 Ảnh hưởng của thời vụ trồng đến bệnh thối gốc rễ trên nghệ tại Hưng Yên
Thời vụ trồng Tỷ lệ bệnh (%) Sau 2 tháng trồng Sau 4 tháng trồng Sau 6 tháng trồng Sau 8 tháng trồng 15/03 8,6 11,6 23,2 24,2 03/04 13,6 19,1 28,3 29,3 20/04 5,1 25,3 41,9 43,4
Qua kết quả thí nghiệm cho thấy: Nhìn chung cây nghệ bị bệnh thối rễ nhẹ ở giai đoạn đầu từ khi nảy mầm đến khi cây được 2 lá thật (2 tháng sau khi trồng). Công thức trồng nghệ vào ngày 3 tháng 4 có tỷ lệ bệnh là 13,6%. Các thời vụ trồng nghệ giữa tháng 3 và gần cuối tháng 4 đều nhiễm bệnh như
nhau. Bệnh thối gốc rễ trên nghệ tăng dần theo các giai đoạn sinh trưởng của cây ở cả 3 thời vụ trồng. Càng về cuối giai đoạn sinh trưởng cây càng bị nhiễm bệnh nặng, điển hình vào đợt điều tra vào tháng 12, một tháng trước khi thu hoạch nghệ, thời vụ trồng nghệ 20-4 bị nhiễm nâm Pythium spp. nặng nhất với tỷ lệ bệnh lên đến 43,4%.
Hai thời vụ trồng nghệ sớm vào ngày 15 tháng 3 và 3 tháng 4 đều bị nhiễm bệnh như nhau và tỷ lệ bệnh ở 2 công thức này tuy thấp hơn thời vụ muộn nhưng tỷ lệ bệnh vẫn khá cao là 24.4% và 29,3%.
Như vậy, tuy hiệu quả phòng trừ không cao nhưng thời vụ trồng nghệ sớm từ 15 tháng 3 có thể giảm ảnh hưởng của bệnh thối gốc rễ so với 2 thời vụ muộn trồng vào đầu tháng 4 và cuối tháng 4.
4.2.8. Thử nghiệm khả năng ức chế sinh trưởng 2 loài Pythium aphanidermatum và Phytopythiumhelicoides bằng thuốc hóa học và vi khuẩn đối kháng trong điều kiện invitro
Trong thí nghiệm này, khả năng ức chế sinh trưởng 2 loài Pythium và
Phytopythium gây bệnh trên nghệ đã được đánh giá trong điều kiện invitro với 2 loại thuốc hóa học và 2 loài vi khuẩn đối kháng.
Hai thuốc hóa học là Hymexazol và Ridomil Gold 68WG. Hymexazol sử dụng trong thí nghiệm là dạng tinh khiết, đặc hiệu Pythium, và là thành phần hoạt chất của thuốc Tachigaren 30SL đăng ký tại Việt Nam. Ridomil Gold 68WG là thuốc được khuyến cáo đặc hiệu cho nhóm nấm trứng.
Hai vi khuẩn đối kháng được là Achromobacter xylosoxidans (mẫu N2) và Alcaligenes faecalis (mẫu HT1) do Trung tâm NCBC nhiệt đới mới phân lập năm 2017, đã được đánh giá hiệu lực và chứng tỏ có khả năng ức chế cao các nấm gây bệnh cây như Phytophthora, Sclerotium và Colletotrichum.
Thí nghiệm được thực hiện trên đĩa Petri với 3 lần lặp lại với mỗi nồng độ của mỗi thuốc. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong Bảng 4.15 và Hình 4.11.
Kết quả thí nghiệm cho thấy:
Thuốc Ridomil Gold 68WG có khả năng ức chế tuyệt đối sinh trưởng của cả 2 loài Pythium/Phytopythium gây bệnh ở cả 3 nồng độ xử lý 1.2; 2.4 và 4.8 g/L tương ứng với nồng độ khuyến cáo 0.5x; 1x và 2x.
Thuốc Hymexazol có hiệu lực ức chế 0% đối Pythium aphanidermatum ở cả 3 nồng độ xử lý 10, 25 và 50 ppm. Quan sát các đĩa thí nghiệm với loài này cho thấy, mặc dù nấm phát triển kín đĩa giống như ở công thức đối chứng, nhưng tản nấm mọc rất thưa và sát bề mặt môi trường. Hymexazol có hiệu lực ức chế khá cao, 72 – 73%, đối với loài Phytopythium helicoides ở cả 3 nồng độ xử lý trên.
Cả 2 loài vi khuẩn đối kháng Achromobacter xylosoxidans (N2) và
Alcaligenes faecalis (HT1) đều không có khả năng ức chế sinh trưởng 2 loài
Pythium/Phytopythium. Cả 2 loài nấm gây bệnh đều phát triển vượt qua vạch vi khuẩn đối kháng mực kín đĩa giống như ở đĩa đối chứng sau 2 ngày thí nghiệm.
Bảng 4.15. Hiệu lực ức chế sinh trưởng của thuốc hóa học và vi khuẩn đối kháng đối với Pythium aphanidermatum và Phytopythium helicoides trên
môi trường nhân tạo
Thuốc/vi khuẩn đối kháng Nồng độ Đơn vị Pythium aphanidermatum Phytopythium helicoides Đường kính tản (cm) Hiệu lực ức chế (%) Đường kính tản (cm) Hiệu lực ức chế (%) Ridomil Gold 68WG (Syngenta) 1.2 g/L 0 100 0 100 2.4 g/L 0 100 0 100 4.8 g/L 0 100 0 100
Hymexazol, tinh khiết, (Sigma) 10.0 ppm 9 0 2.5 72.2 25.0 ppm 9 0 2.5 72.2 50.0 ppm 9 0 2.4 73.3 Achromobacter xylosoxidans (N2) 9 0 9 0 Alcaligenes faecalis (HT1) 9 0 9 0 Đối chứng (không xử lý) 9 0 9 0
Ghi chú: Thí nghiệm được đánh giá sau 2 ngày nuôi cấy vì sau 2 ngày nấm ở đĩa đối chứng đã sinh trưởng kín đĩa
Hình 4.13. Hiệu lực ức chế sinh trưởng của thuốc hóa học và vi khuẩn đối kháng đối với Pythium aphanidermatum và Phytopythium helicoides trên
4.2.9. Khả năng ức chế sinh trưởng của một số loại thuốc hóa học đối với nấm Pythium spp ngoài đồng ruộng
Theo kết quả điều tra của nhóm BVTV trung tâm cây thuốc Hà Nội, bệnh thối gốc rễ phát sinh từ giai đoạn cây con nhưng tỷ lệ bệnh rất thấp, bệnh bị hại nặng hơn khi cây bước vào giai đoạn hình thành củ. Kết hợp với điều tra định kỳ chúng tôi đã theo dõi và xác định thời điểm thực hiện thí nghiệm vào đầu tháng 8, đây là giai đoạn mẫm cảm của cây nghệ với bệnh thối gốc rễ. Do đó để góp phần vào quy trình phòng trừ tổng hợp loại tác nhân này chúng tôi tiến hành thí nghiệm thử thuốc để khảo sát và đánh giá hiệu lực một số loại thuốc chứa hoạt chất phòng trừ Pythium spp. như hoạt chất metalaxyl, mancozeb, hymexazon kết quả thí nghiệm được thể hiện tại bảng 4.16.
Bảng 4.16. Ảnh hưởng của một số thuốc hóa học đến bệnh thối gốc rễ trên nghệ
Công thức
Tỷ lệ bệnh (%) Trước khi
phun
Sau khi phun 7 ngày Sau khi phun 14 ngày Sau khi phun 21 ngày Mataxyl 500 WP 14,7 18,0 26,7 29,8 Tachigaren 30 L 12,0 28,7 35,3 42,7 Ridomil Gold 68 WP 9,3 44,0 52,7 40,0 Nước lã 13,3 61,3 71,3 83,3
Qua bảng kết quả cho thấy: Ở cả 3 công thức xử lý thuốc thì hiệu quả phòng trừ bệnh thối gốc rễ đều cao hơn so với với công thức đối chứng sau khi phun 7 ngày, 14 ngày và 21 ngày, tuy nhiên các công thức thuốc khác nhau đều ảnh hưởng khác nhau đến bệnh thối gốc rễ trên nghệ.
Hiệu quả phòng trừ của các thuốc thể hiện rõ nhất sau 7 ngày phun trong đó công thức xử lý Mataxyl 500 WP liều lượng 1,6g/ 1l nước có tỉ lệ bệnh sau 7 ngày phun 18,0%, sau đó đến công thức tưới gốc bằng thuốc Tarchigaren 30L có tỉ lệ bệnh sau 7 ngày 28,7% và công thức sử dụng thuốc Ridomil Gold 68WG có tỉ lệ bệnh sau 7 ngày là 44,0%. Trong khi đó ở công thức đối chứng tỷ lệ bệnh vẫn tiếp tục tăng cao sau 7 ngày chúng tôi theo dõi, cao hơn 60%. Sau khi phun