Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Bệnh nấm hại trên cây gừng. - Bệnh nấm hại trên cây nghệ.
3.2.2. Vật liệu nghiên cứu:
3.2.2.1. Nguồn bệnh và nguồn giống
Các mẫu bệnh thu thập tại Hưng Yên, Quảng Ninh, Hà Nội. Giống cây nghệ vàng được trồng tại TT cây thuốc HN.
3.2.2.2. Môi trường phân lập và nuôi cấy nấm:
Môi trường WA Thành phần:
Agar 20 g
Nước cất 1000 ml
Môi trường PDA
Thành phần:
Khoai tây 200 g Glucose 20 g Agar 20 g
Nước cất 1000 ml
PDA là một môi trường giàu dinh dưỡng. Khoai tây không cần gọt vỏ, chỉ cần rửa sạch thái nhỏ thành từng miếng vuông khoảng 1cm2. Sau đó đun khoai
tây cho đến khi mềm, lọc bằng vải màn để lấy dịch nước khoai tây. Pha 1 lít dịch nước khoai tây với 20g đường và 20g agar.
Môi trường này dùng làm môi trường cấy truyền cho các loại nấm sau khi đã được cây phân lập.
Môi trường chọn lọc Fusarium Thành phần: Thạch rau câu: 20g Peptone: 15g KH2PO4: 1g MgSO4.7H2O: 0,5g Terrachlor: 1g Nước cất: 1 lít
Dung dịch môi trường được đem hấp vô trùng rồi để nguội tới 550C, cho tiếp vào môi trường dung dịch hóa chất gồm:
Streptomycin sulfate: 1g Neomycin sulfate: 0,12g
Hòa với 10ml nước cất vô trùng
Môi trường PCA
- Thành phần: + Khoai tây: 200g + Cà rốt: 200g + Agar: 20g
+ Nước cất: 1000ml
- Phương pháp điều chế: chọn khoai tây, cà rốt không bị bệnh, chưa nảy mầm, rửa sạch, gọt vỏ và cân mỗi loại 200g, thái mỏng thành từng miếng, cho vào 1000ml nước cất rồi đun sôi, lọc lấy dịch vào bình tam giác và cho thêm nước cất vừa đủ, sau đó đun sôi lại trên bếp điện, khi sôi lăn tăn cho tiếp 20g agar, vừa cho agar vừa khuấy đều cho agar tan hết, đổ ra bình tam giác và bịt kín miệng bình bằng giấy bạc, hấp khử trùng ở 1210C, áp suất 1,5 atm, trong khoảng 30 – 45 phút, hấp xong để nguội đến 550C rồi đổ ra đĩa petri. Có thể bảo quản môi trường trong tủ lạnh.
- Môi trường PCA là môi trương giàu dinh dưỡng, dùng để cấy truyền đỉnh sinh trưởng và nghiên cứu khả năng sinh trưởng của nấm.
Môi trường chọn lọc nấm PhytoPhthora và Pythium (PSM)
Carot (không gọt vỏ): 20g Khoai tây (không gọt vỏ): 20g Agar: 12g
Nước cất: 1 lít
Đun khoai tây và cà rốt đến khi nhừ, sau đó chiết lấy dịch nước, cho thạch vào, đem hấp khử trùng. Sau khi hấp để môi trường nguội đến khoảng 550C thì cho các kháng sinh: Piramicin 10 ppm, Rifampicin 50 ppm và Hymexazol 50 ppm.
Pimaricin 0,4 ml hòa vào hộp nhựa nhỏ chứa 6,7 ml nước cất vô trùng (hộp nhựa này cần được bọc kín vì khi hóa chất này tiếp xúc với ánh sáng sẽ bị phân hủy và mất hiệu lực).
Rifampicin 0,05g hòa vào hộp nhựa nhỏ chứa 6,7ml Methanol.
Sau đi đổ môi trường xong, giữ các đĩa môi trường trong điều kiện tối như trong tủ hay hộp giấy sạch (Nguyễn Kim Vân và cs., 2006)
Môi trường lá cẩm chướng – thạch rau câu (CLA)
Đây là một môi trường tự nhiên trong đó có các mẩu lá cẩm chướng đã được khử trùng và được đặt trên bề mặt của môi trường WA 2% đã vô trùng. Các mẩu lá cẩm chướng được lấy từ lá cẩm chướng tươi không có tàn dư của các thuốc trừ sâu bệnh, ngay sau khi thu hái lá cẩm chướng được cắt thành từng mẩu nhỏ từ 5-6 mm và được sấy khô bằng tủ sấy tại nhiệt độ 700C trong 3-4 giờ cho đến khi khô kiệt. Sau đó đóng gói các mẩu lá trong túi giấy thiếc hoặc túi nilon và được khử trùng bằng tia phóng xạ. Lá cẩm chướng có thể được bảo quản tại nhiệt độ 2-50C trong 12 tháng trước khi đem ra sử dụng.
Môi trường CMA (Corn Meal Agar)
Thành phần môi trường CMA bao gồm: Bột ngô : 30g
Agar : 20g
3.2.2.3. Các hóa chất
Agar, đường glucose, khoai tây, bột ngô, cồn, gia ven (NaOCl), nước cất, và các hóa chất khác.
3.2.2.4. Dụng cụ
Panh, dao mổ, đèn cồn, đĩa petri, que cấy nấm, que cấy vi khuẩn, túi xi măng, túi nilong, giấy vệ sinh vô trùng.
3.2.2.5. Thiết bị
Buồng cấy vô trùng (để chế tạo môi trường) Kính hiển vi soi nổi
Kính hiển vi quang học Nồi hấp.