CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Dung môi chiết Etanol: C2H6O; M= 46.07g/mol; chất lỏng không màu tan hoàn toàn trong nước, khối lượng riêng D= 0.789g/ml; nhiệt độ sơi 78℃.
Một số hóa chất khác cũng được sử dụng
Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ khối GC-MS
Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) tại Khoa Sinh trường Đại Học Sư Phạm- Đại Học Đà Nẵng.
16
Ngồi ra cịn dùng một số trang thiết bị khác như máy cô quay chân không, máy hút chân khơng, cân phân tích, bộ chiết soxhlet, cốc thủy tinh, giấy lọc, phễu chiết, các loại pipet, tủ sấy, lò nung,...
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Xác định một số chỉ tiêu hóa lý 2.2.1. Xác định một số chỉ tiêu hóa lý
2.2.1.1. Độ ẩm Tiến hành Tiến hành
- Chuẩn bị các cốc sứ được rửa sạch, được đánh số thứ tự, và được sấy khô trong tủ sấy đến khối lượng không đổi m0. Sấy xong cho vào bình hút ẩm để nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân khối lượng cốc sứ. Ghi lại khối lượng của từng cốc để tính độ ẩm.
- Mẫu đễ xác định độ ẩm là nguyên liệu bột thân cây Chùm ngây, cân lấy khối lượng chính xác m1 trên cân phân tích, cho vào cốc sứ chuẩn bị sẳn và đem đi sấy ở nhiệt độ 100℃. Cứ sau 1 giờ lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi đem đi cân đến khối lượng khơng đổi m2.
Cách tính độ ẩm
- Độ ẩm của mỗi chén là hiệu số giữa khối lượng của mẫu trước và khối lượng mẫu sau khi cân. Suy ra độ ẩm trung bình của 3 mẫu.
- Độ ẩm của mẫu bột thân cây chùm ngây được tính bằng cơng thức:
𝑾 = 𝒎𝟏 − 𝒎𝟐
𝒎𝟏 × 𝟏𝟎𝟎%
Trong đó,
W: độ ẩm của nguyên liệu (%) m1: khối lượng của chén sứ (gam) m2: khối lượng của nguyên liệu (gam)
- Độ ẩm chung của mẫu sẽ là độ ẩm trung bình của 3 mẫu
2.2.1.2. Hàm lượng tro
Tro tồn phần: Là khối lượng cặn cịn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một mẫu thử trong điều kiện nhất định.Để xác định hàm lượng hữu cơ tổng và các nguyên tố vô cơ trong cơ thể động thực vât người ta dùng phương pháp tro hóa mẫu.
17
Tiến hành
- Các mẫu sau khi được xác định độ ẩm sẽ mang đi tro hóa.
Đem mẫu đi than hóa sơ bộ trên bếp điện và cho vào lò nung ở 200℃ trong khoảng 2 giờ đầu, sau đó tiếp tục nâng nhiệt độ lên 500℃ trong thời gian là 4 giờ. Cho dến khi thu được tro trắng.
- Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phịng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu. - Sau đó cho vào nung khoảng một tiếng lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phịng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu cho đến khi khối lượng của chén sứ và bột thân cây chùm ngây sau khi tro hóa khơng đổi.
- Tiếp tục thực hiện các thao tác cho đến khi khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp có sai số khơng vượt q 0,001 gam thì dừng lại
Cách tính kết quả
Hàm lượng tro được tính bằng cơng thức
%𝒕𝒓𝒐 = 𝒎𝟐− 𝒎𝟎
𝒎𝟏 × 𝟏𝟎𝟎%
Trong đó:
m0 : khối lượng chén sứ ban đầu (g).
m1 : khối lượng nguyên liệu bột thân Chùm ngây (g).
m2 : khối lượng của chén sứ và nguyên liệu bột thân Chùm ngây sau khi tro hóa (g).
2.2.1.3. Hàm lượng kim loại nặng
Hàm lượng kim loại nặng trong bột thân cây chùm ngây được xác định bằng phương pháp đo phổ nguyên tử hấp thụ AAS tại khoa Sinh- Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng.
2.2.2 . Khảo sát các yếu tố ảnh hưỡng đến quá trình chiết mẫu thực vật
2.2.2.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật
Chiết là dùng dung mơi thích hợp có khả năng hịa tan chất đang cần tách và tinh chế để tách nó ra khỏi môi trường rắn hoặc lỏng khác. Mẫu thực vật thường
18
được chiết theo phương pháp chiết rắn- lỏng. Có nhiều kỹ thuật chiết như: chiết ngâm dầm, chiết soxhlet, chiết siêu âm, phương pháp lôi cuốn hơi nước,....
Mẫu thực vật được chiết theo phương pháp chiết rắn – lỏng bằng kỹ thuật chiết Soxhlet: Mẫu thực vật khô được chiết với dung môi ethanol. Cât loại dung môi bằng máy cô quay chân không sẽ thu được cao chiết để tiếp tục nghiên cứu.
Thực hiện chiết Soxhlet khảo sát lượng cao thu được tại tỉ lệ và thời gian khác nhau:
+ Khảo sát theo các tỉ lệ lần lượt là 1 : 10, 1 : 15, 1 : 20, 1 : 25 và 1 : 30 với 10g nguyên liệu cho mỗi mẫu thử.
+ Khảo sát theo thời gian chiết lần lượt là 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ với 10g nguyên liệu bột/ 200 mL dung môi ethanol.
Kỹ thuật chiết Soxhlet
Dụng cụ
Gồm một bình cầu A đặt trong một bếp đun có thể điều chỉnh nhiệt độ. Một bộ phận chứa mẫu bột cây, gồm ba ống: ống D có đường kính lớn, ở giữa, để chứa bột cây; ống B có đường kính trung bình, để dẫn dung mơi từ bình A bay lên, đi vào ống D chứa bột cây; ống E có đường kính nhỏ, là ống thơng nhau, để dẫn dung môi từ trả ngược trở lại bình cầu A. Trên cao nhất là ống C ngưng hơi.
Tiến hành
- Bột nguyên liệu khô đựng trong túi bằng giấy lọc được đặt trực tiếp trong ống D. Lưu ý đặt vài viên bi thủy tinh dưới đáy ống D để tránh nghẹt lối ra vào của ống thông nhau E. Không được để lượng bột cây trong ống D vượt cao hơn mức cong của ống thơng nhau E.
- Rót dung mơi đã lựa chọn vào bình cầu bằng cách tháo hệ thống nút mài số (2), như thế dung môi sẽ thấm ướt bột cây rồi mới chạy xuống bình cầu, ngang qua ống thơng nhau E. Lưu ý để thể tích lượng dung mơi trong bình cầu khơng được nhiều hơn 2/3 thể tích của bình cầu.
- Kiểm tra hệ thống kín. Mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi. Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt độ sao cho dung mơi trong bình cầu sơi nhẹ đều. Dung mơi tinh khiết khi được đun sẽ bốc hơi lên cao, theo ống B lên cao hơn, rồi bị ống
19
ngưng hơi làm lạnh ngưng tụ thành thể lỏng. Rơi thẳng xuống ống D đang chứa bột cây. Dung môi ngấm vào bột cây và chiết những chất hữu cơ nào có thể hịa tan trong dung mơi. Theo q trình đun nóng, lượng hơi rơi vào ống D càng nhiều, mức dung môi dâng lên cao trong ống D và đồng thời cũng dâng lên cao trong ống E, vì đây là ống thơng nhau. Đến một mức cao nhất trong ống E, dung mơi sẽ bị rút hết về bình cầu A, lực hút này sẽ rút hết lượng dung môi đang chứa trong ống D.
- Bếp vẫn tiếp tục đun và một qui trình mới vận chuyển dung mơi theo như mơ tả ban đầu. Các hợp chất được hút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung mơi tinh khiết là được bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết. Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong bột cây.
- Kiểm tra chiết kiệt bằng cách tắt bếp để nguội và mở hệ thống chỗ nút mài (3), rút lấy một giọt dung môi và thử trên mặt kiếng, nếu thấy khơng cịn vết gì trên kiếng là đã chiết kiệt. Sau khi hồn tất, lấy dung mơi chiết ra khỏi bình cầu A, đuổi dung môi, thu được cao chiết.
20
Ưu điểm:
- Tiết kiệm dung môi, chỉ một lượng nhỏ dung môi mà chiết kiệt được mẫu cây. - Không phải tốn công lọc và châm dung môi mới.
- Chỉ cần cắm điện, mở nước hồn lưu là có thể thực sự chiết.
- Chiết kiệt hợp chất trong bột cây vì bột cây ln được chiết bằng dung môi tinh khiết.
Nhược điểm:
- Kích thước máy soxhlet làm giới hạn lượng bột cây cần thiết, muốn chiết lượng lớn bột cần phải lặp lại nhiều lần.
- Trong quá trình chiết, các hợp chất chiết ra từ bột cây được trữ lại trong bình cầu, nên chúng ln bị đun nóng ở nhiệt độ sơi của dung mơi vì thế nếu hợp chất nào kém bền có thể bị hư hại.
- Dụng cụ có giá thành cao khó, khó bảo quản.
2.2.2.2. Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử AAS
- Các nguyên tử ở trạng thái bình thường thì chúng khơng hấp thu hay bức xạ năng lượng nhưng khi chúng ở trạng thái tự do dưới dạng những đám hơi nguyên tử thì chúng hấp thu và bức xạ năng lượng.
- Mỗi nguyên tử chỉ hấp thu những bức xạ nhất định tương ứng với những bức xạ mà chúng có thể phát ra trong quá trình phát xạ của chúng.
- Khi nguyên tử nhận năng lượng chúng chuyển lên mức năng lượng cao hơn gọi là trạng thái kích thích. Q trình đó gọi là q trình hấp thu năng lượng của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi và tạo ra phổ của nguyên tử đó. Phổ sinh ra trong q trình này gọi là phổ hấp thu nguyên tử. Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử dựa trên sự xuất hiện của phổ hấp thụ nguyên tử khi nguyên tử tồn tại ở trạng thái khí tự do và trong mức năng lượng cơ bản.
- Phương pháp này có thể phân tích được lượng vết của hầu hết các kim loại và cả những hợp chất hữu cơ hay anion khơng có phổ hấp thụ ngun tử. Do đó nó được sử dụng rộng rãi trong các nghành: địa chất, cơng nghiệp hố học, hoá dầu, y học, sinh hố, cơng nghiệp dược phẩm, nơng nghiệp và thực phẩm…
21
Hình 2.3. Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS
2.2.2.3. Phương pháp định danh thành phần hóa học các hợp chất
- Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp. Thiết bị GC-MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mơ tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối.
- Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật này (GC-MS), các nhà hố học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng và có cách giải quyết đối với một số hóa chất. Ngày nay, người ta ứng dụng kỹ thuật GC-MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các nghành như y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm…
- Việc định danh thành phần hóa học có trong dịch chiết lá chùm ngây thu được bằng phương pháp chiết soxhlet, thực hiên thông qua việc đo phổ GC-MS tại Trung Tâm Kỹ Thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 2 - Đà Nẵng.
22
23
2.2.3. Sơ đồ điều chế cao chiết
Điều chế cao tổng:
Nguyên liệu là thân cây Chùm ngây sau khi thu hái, rửa sạch, phơi, sấy khô rồi đem xay nhỏ thành bột. Lấy 500gam bột để tiến hành chiết Soxhlet. Với 500g bột ta chia làm nhiều lần với dụng cụ chiết Soxhlet 500ml.
- Do bộ dụng cụ chiết Soxhlet không đủ để làm với 500g nên ta sẽ chia ra từng lượng nhỏ để hoàn thành đến khi hết 500g.
- Sau khi chiết hết nguyên liệu bột thân cây chùm ngây với bộ chiết Soxhlet, ta thu lại toàn bộ dịch chiết.
- Dịch chiết thu được sẽ được mang đi cô quay để lấy cao tổng trong Etanol.
Điều chế cao trong Chloroform:
Thân cây
chùm ngây
Xử lí ngun liệu:- Xắt lát mỏng, phơi khơ - Xay nhỏ Bột thân cây chùm ngây - Xác định độ ẩm. - Xác định hàm lượng tro - Xác định hàm lượng kim loại nặng
1. Chiết Soxhlet trong dung môi Etanol 2. Khảo sát thời gian chiết
3. Khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng
Dịch chiết trong Etanol
Cô quay chân không
Cao trong Etanol 1. Thử hoạt tính sinh học 2. Đo GC-MS Cao trong nước Cao trong Chloroform
24
- Sau khi thu được cao tổng trong Etanol. Một phần cao tổng này sẽ được hòa tan và chiết với nước, Chloroform để thu cao trong Chloroform.
- Phân lớp với Chloroform, chiết 3-4 lần với khoảng 700mL chloroform. Tổng dịch chiết khoảng 500mL, cất loại dung môi thu được cao trong Chloroform.
2.2.4. Thử hoạt tính sinh học của cao bột thân chùm ngây trong dung môi etanol etanol
Cao của bột thân cây chùm ngây được chiết trong dung môi etanol được xác định hoạt tính chống oxy hóa qt gốc tự do DPPH và hoạt tính kháng viêm
Thiết bị, dụng cụ
- Máy đọc ELISA Bio-Rad (Laboratories,Mỹ) - Bể ổn nhiệt, thiết lập ở 37oC
- Micropipet loại 10 μL, 20 μL, 200 μL, 1000 μL (Isolab, Đức) - Đầu côn 20 μL, 200 μL, 1000 μL
- Phiến 96 giếng (SPL Life Sciences, Hàn Quốc).
Hóa chất
- DPPH (1,1- Diphenyl 1-2 picrylhydrazyl) (sigma, Mỹ) - Nước cất 2 lần bằng máy A4000D (Bibby Scientific, Anh) - DMSO (Merck, Đức)
- MeOH kỹ thuật
- Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco, Mỹ) - Phosphate buffer saline (PBS, Gibco, Mỹ)
- Fetal bovine serum (FBS, Gibco, Mỹ)
- MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (DUCHEFA biochemie, Hà Lan)
- LPS ( lipopolysacharide) (Sigma, Mỹ)
- H2NC6H4SO2NH2 (Sulfanilamide) (BDH Chemical, Anh)
- C10H7NHCH2CH2NH2.2HCl (N-alpha-naphthyl-ethylenediamine) (BDH Chemical, Anh)
25
Chuẩn bị mẫu
Mẫu các hợp chất này được pha thành dung dịch gốc với nồng 100 mg/mL (đối với cặn chiết) trong DMSO, sau đó pha lỗng ở các nồng độ khác nhau.
2.2.4.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính quét gốc tự do DPPH
Nguyên lý
1,1- Diphenyl 1-2 picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu tím và có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 517nm. Khi có mặt chất chống oxi hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2- Diphenyl-1-1picryhydrazine (DPPH-H) có màu vàng. Đo độ giảm hấp thụ ở bước sóng 517nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxi hóa.
DPPH màu tím + RH -> DPPH-H + R
Các bước tiến hành
Mẫu thử được pha trong DMSO. DPPH pha loãng trong MeOH với nồng độ thích hợp. 10 μL mẫu thử được ủ với 190 μL dung dịch DPPH, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 20 phút và đo trên máy ELISA ở bước sóng 517 nm. Chất đối chứng Ascorbic được dùng để kiểm sốt độ ổn định và đánh giá hoạt tính ức chế tương đương [1, 2]. Các phép thử được lặp lại 3 lần.
Kết quả được tính theo cơng thức sau:
% ức chế = 100 – [(ODs) / (ODc) x 100] - ODs: Mật độ quang trung bình của mẫu thử
- ODc: Mật độ quang trung bình của mẫu control (khơng có mẫu thử, chỉ có DPPH, coi như giá trị ức chế 0%).
2.2.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm
Nguyên lý
Gốc tự do nitric oxide (•NO) được sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau. Dạng •NO xuất tiết có mặt ở các tế bào như đại thực bào, nguyên bào sợi hay tế bào gan thường được sản sinh với lượng lớn khi xuất hiện các đáp ứng viêm [3].
Một phương pháp được sử dụng để xác định gián tiếp •NO là đo màu các thành phần sản phẩm của nó (nitrate và nitrite). Phản ứng này địi hỏi rằng nitrate (NO3) đầu tiên được giảm thành nitrite (NO2), do tác động của nitrate reductase.
26
Nitrite được phát hiện và
phân tích bằng cách hình thành một màu hồng đỏ khi mẫu thử có chứa NO2- với thuốc thử Griess.
Khi thêm axit sulphanilic, nitrite tạo thành muối diazonium, sau đó các thuốc nhuộm azo (N-alpha-naphthyl-ethylenediamine) được thêm vào để tạo thành màu hồng.
Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phương pháp so màu, đo độ suy giảm màu để đánh giá khả năng sống sót của tế bào. Ở các tế bào sống, hệ enzym oxidoreductase hoạt động mạnh, những enzyme này có khả năng phân giải MTT thành dạng formazan khơng hồ tan, màu tím đậm. Do vậy, tỉ lệ tế bào sống sót được suy ra từ lượng formazan tạo thành từ MTT. Lượng formazan tạo thành được hoà tan bởi dung môi hữu cơ (DMSO, propanol) và đo độ hấp thụ ở bước sóng 570 mm. Khả năng gây độc tế bào của các mẫu thử nghiệm được suy ra từ việc đánh giá khả năng sống sót của tế bào [4].