CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.2.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm
Nguyên lý
Gốc tự do nitric oxide (•NO) được sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau. Dạng •NO xuất tiết có mặt ở các tế bào như đại thực bào, nguyên bào sợi hay tế bào gan thường được sản sinh với lượng lớn khi xuất hiện các đáp ứng viêm [3].
Một phương pháp được sử dụng để xác định gián tiếp •NO là đo màu các thành phần sản phẩm của nó (nitrate và nitrite). Phản ứng này địi hỏi rằng nitrate (NO3) đầu tiên được giảm thành nitrite (NO2), do tác động của nitrate reductase.
26
Nitrite được phát hiện và
phân tích bằng cách hình thành một màu hồng đỏ khi mẫu thử có chứa NO2- với thuốc thử Griess.
Khi thêm axit sulphanilic, nitrite tạo thành muối diazonium, sau đó các thuốc nhuộm azo (N-alpha-naphthyl-ethylenediamine) được thêm vào để tạo thành màu hồng.
Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phương pháp so màu, đo độ suy giảm màu để đánh giá khả năng sống sót của tế bào. Ở các tế bào sống, hệ enzym oxidoreductase hoạt động mạnh, những enzyme này có khả năng phân giải MTT thành dạng formazan khơng hồ tan, màu tím đậm. Do vậy, tỉ lệ tế bào sống sót được suy ra từ lượng formazan tạo thành từ MTT. Lượng formazan tạo thành được hoà tan bởi dung môi hữu cơ (DMSO, propanol) và đo độ hấp thụ ở bước sóng 570 mm. Khả năng gây độc tế bào của các mẫu thử nghiệm được suy ra từ việc đánh giá khả năng sống sót của tế bào [4].
Các bước tiến hành
Tế bào RAW264.7 được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường DMEM ở 37oC, 5%
CO2 với 10% FBS, penicillin và streptomycin sulphate. Sau đó chúng được ni cấy trong giếng phiến 96 với mật độ 2,5 x 105 tế bào/giếng. Tế bào được kích thích với
27
2µL LPS (0.1mg/mL) trong 24 giờ với sự có mặt của các hợp chất thử ở nhiều nồng độ khác nhau, được pha sẵn trong DMSO. Dịch nổi của tế bào phản ứng với thuốc thử Griess. NaNO2 ở các nồng độ khác nhau được sử dụng để xây dựng đường chuẩn. Độ hấp thụ được đo ở 570 nm. Cardamonin được sử dụng làm mẫu đối chứng [5].
Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đánh giá các hoạt tính invitro được bổ
sung dung dịch MTT (0.5mg/ml pha trong PBS), ủ 4h ở 37oC và 5% CO2. Sau đó hút
bỏ hết môi trường trên bề mặt, kết tủa formazan được hòa tan trong isopropanol. Độ hấp thụ được đo ở 570 nm.
Tính kết quả
- Tính % ức chế NO
%UC =([Xtb](mẫu thử)-[Xtb]LPS)/([Xtb]Control-[Xtb]LPS)*100
Trong đó: [Xtb] : nồng độ NO trung bình, được tính tốn dựa vào đường chuẩn NaNO2.
- Tính giá trị CS % (% Cell Survival).
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, Giá trị CS(%) được tính theo cơng thức:
𝐶𝑆% = [OD (mẫu thử) – OD ( ngày 0)
OD (DMSO) – OD ( ngày 0) × 100] ± 𝜎
Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn σ được tính theo cơng thức:
𝜎 = √(∑ 𝑥𝑖− 𝑥̅)2
𝑛 − 1 Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i
x ̅: giá trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại - Tính giá trị IC50
Nồng độ ức chế 50%, IC50 được xây dựng trên 5 nồng độ thử nghiệm. Giá trị IC50 được xác định theo phương pháp hồi quy tuyến tính trên phần mềm Graphpad Prism 5.0.
28