2.3.5.2. Chẩn đoán vi sinh
Dựa vào chẩn đoán trực tiếp và phân lập vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm như đàm, máu,…tùy theo thể bệnh. Nuôi cấy lên các mơi trường thích hợp để phân lập, xác định vi khuẩn dựa vào hình dáng, tính chất ni cấy, tính chất sinh vật hóa học và khả năng gây bệnh thực nghiệm. Xác định type bằng phản ứng ngưng kết hoặc phản ứng phình vỏ với kháng huyết thanh đặc hiệu type [31].
2.3.5.3. Khả năng gây bệnh
Klebsiella pneumoniae là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện, xảy ra chủ yếu
trên những bệnh nhân bị suy kiệt, suy giảm miễn dịch và ở môi trường bệnh viện. Ngày càng có nhiều loại kháng sinh phổ rộng, việc sử dụng kháng sinh rộng rãi và thiếu thận trọng làm cho vi khuẩn được chọn lọc bởi kháng sinh và tạo nên sức đề kháng đối với kháng sinh [27].
Các thủ thuật như thông tim, nội soi,... được áp dụng ngày càng nhiều trong các bệnh viện. Tuy nhiên, khi áp dụng các thủ thuật này có thể đưa vi khuẩn vào cơ thể qua ống thông [31].
2.3.5.4. Các triệu chứng thường gặp
Nhiễm trùng K. pneumoniae thường đi kèm với các triệu chứng như sốt, ho, sưng đỏ, khó thở, đau ngực và đau đớn tại vết thương, mệt mỏi, có các triệu chứng tương tự như cúm. Đau buốt khi đi tiểu, nước tiểu có máu, đục và nặng mùi,… Sốt cao, cứng cổ, đau đầu, buồn nôn và nôn, nhạy cảm với ánh sáng, run rẩy, ớn lạnh [31].
2.3.5.5. Các bệnh thường gặp
K. pneumoniae có thể gây ra các bệnh ở người như bệnh viêm phổi, nhiễm
trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng da, nhiễm trùng máu và viêm màng não [27].
2.3.5.6. Phòng bệnh và điều trị
a. Phịng bệnh
Chưa có vaccine phịng bệnh đặc hiệu. Cần phải tránh những điều kiện thuận lợi cho nhiễm trùng cơ hội xuất hiện bằng cách phải nâng cao sức đề kháng của người bệnh và dự phòng tốt các nhiễm trùng bệnh viện [31].
b. Điều trị bệnh
Dựa vào kết quả của kháng sinh đồ để chọn kháng sinh công hiệu. Cần tuân theo các hướng dẫn tiêu chuẩn về liệu pháp kháng sinh [31].
2.4. Một số phương pháp tách chiết các chất từ thực vật [17]
- Khái niệm: Là quá trình tách và phân ly một hoặc một số chất ra khỏi ngun liệu dựa vào q trình chuyển một chất hịa tan trong một pha lỏng với một pha lỏng khơng hịa tan với nó.
- Mục đích của chiết:
+ Chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung mơi này vào một thể tích nhỏ dung mơi khác nhằm nâng cao nồng độ của các chất nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu.
+ Ngồi ra cịn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách các hợp chất trong hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp. Thường dùng trong phân tách các hợp chất tự nhiên.
2.4.1. Tách chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước
- Nguyên tắc: Dựa trên nguyên lý của q trình chưng cất một hỗn hợp khơng tan lẫn vào nhau là nước và tinh dầu. Khi hỗn hợp này được gia nhiệt hai chất đều bay hơi. Nếu áp suất của hơi nước cộng với áp suất của tinh dầu bằng áp suất của mơi trường thì hỗn hợp sơi và tinh dầu được lấy ra cùng với hơi nước.
- Ưu điểm:
+ Thiết bị gọn gàng, dễ chế tạo, quy trình sản xuất đơn giản.
+ Trong q trình chưng cất có thể phân chia các cấu tử bằng cách ngưng tụ từng phần theo thời gian.
+ Thời gian tương đối nhanh, nếu chưng cất gián tiếp thì mất khoảng 6-10 giờ, nếu thực hiện liên tục thì mất 30 phút đến 1 giờ.
+ Có thể tiến hành chưng cất với các cấu tử chịu được nhiệt độ cao. - Nhược điểm :
+ Không áp dụng phương pháp này với những ngun liệu có hàm lượng tinh dầu thấp vì thời gian chưng cất kéo dài, tốn rất nhiều hơi và nước ngưng tụ.
+ Tinh dầu thu được có thể bị giảm chất lượng nếu có chứa các cấu tử bị thủy phân.
+ Khơng có khả năng tách các thành phần bay khó bay hơi trong các thành phần của nguyên liệu.
+ Hàm lượng tinh dầu còn lại trong nước chưng tương đối lớn. + Tiêu tốn một lượng nước khá lớn để làm những tụ hỗn hợp hơi.
2.4.2. Tách chiết bằng soxlet
Đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra. Dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục và tiết kiệm dung môi. Các dung môi thường dùng là n-hexan (C6H14), diclometan (CH2Cl2), etanol (C2H5OH).
2.4.3. Phương pháp ngấm kiệt
Chiết xuất ngấm kiệt được tiến hành bằng cách thường xuyên tác các chất chiết ra khỏi nguyên liệu. Phương pháp này thường xuyên dùng dung mơi sạch nên có nhược điểm là mất nhiều thời gian.
2.4.4. Chiết siêu âm
Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng khả năng chiết xuất. Chiết siêu âm là phương pháp chiết sử dụng sóng với tần số 20000 Hz. Dùng siêu âm có thể rút ngắn thời gian chiết nhờ tác dụng của siêu âm, làm tăng diện tích giữa 2 pha bằng cách phân tán chúng ra thành những hạt nhỏ, phá vỡ các màng tế bào, tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp.
2.4.5. Chiết xuất ngược dòng
Nguyên tắc của chiết xuất ngược dòng là hướng di chuyển của dung mơi ngược dịng với hướng di chuyển của nguyên liệu, bản chất là phương pháp chiết xuất nhiều lần được cải tiến để tận dụng khả năng hịa tan của dung mơi. Ngun liệu lần lượt được chiết bằng những dịch chiết có nồng độ hoạt chất giảm dần, nguyên liệu kiệt nhất sẽ được chiết xuất bằng dung môi mới và dùng làm dung mơi chiết cho các bình tiếp theo.
2.4.6. Chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn
Thay vì sử dụng các loại dung mơi hữu cơ chúng ta có thể sử dụng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn (31,10C, 73 atm), nước ở trạng thái siêu tới hạn (3740C, 218 atm) hay chất lỏng ở dạng ion tại nhiệt độ phòng, hệ 2 pha, hệ thống khơng có dung mơi sử dụng bề mặt bên trong của đất sét, zeolit, silic oxit và nhôm. Sử dụng phương pháp chiết này cho phép thu được sản phẩm có độ tinh khiết, có
màu sắc, 9 hương vị hoàn toàn giống với tự nhiên, không bị biến đổi như trong các phương pháp chiết khác.
2.4.7. Tách chiết bằng dung môi
- Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên ngun tắc sử dụng dung mơi thích hợp để hòa tan những cấu tử mang hương trong nguyên liệu đã được xử lý thành dạng thích hợp ở nhiệt độ phịng. Dung mơi chiết sẽ ngấm qua thành tế bào của nguyên liệu, các hợp chất trong tế bào sẽ hịa tan vào dung mơi, sau đó sẽ xuất hiện quá trình thẩm thấu giữa dịch chiết bên trong dung mơi với bên ngồi dung môi do chênh lệch nồng độ. Sau khi chiết phải thực hiện quá trình tách dung môi ở áp suất thấp để thu tinh dầu.
- Yêu cầu của dung môi chiết:
+ Có nhiệt độ sơi thấp, nhưng khơng q thấp để hạn chế tổn thất dung môi và thuận lợi trong việc ngưng tụ hơi dung môi.
+ Khơng tương tác hóa học với tinh dầu. + Có khả năng thu hồi tái sử dụng.
+ Độ nhớt thấp để không làm giảm tốc độ khuếch tán
+ Có khả năng hịa tan tinh dầu lớn, nhưng hịa tan hợp chất khơng được hòa tan nước để tránh làm lỗng dung mơi và hạn chế khả năng hòa tan tinh dầu của dung môi.
+ Dung mơi phải tinh khiết, khơng được ăn mịn thiết bị, không gây mùi lạ đối với tinh dầu và ít độc hại với con người.
+ Khi bay hơi dung mơi khơng để lại cặn vì cặn cịn lại từ dung mơi có thể ảnh hưởng xấu hoặc phá hủy mùi thơm của tinh dầu.
+ Dung môi rẻ tiền, dễ kiếm.
2.5. Một số phương pháp đánh giá tác động kháng khuẩn
2.5.1. Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch
- Nguyên lý: Dịch chiết được bơm vào các giếng thạch trong môi trường MHA đã được đục lỗ, bề mặt mơi trường MHA có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm, mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với dịch chiết được biểu hiện bằng đường kính vịng kháng khuẩn xung quanh các giếng thạch có chứa dịch chiết. Đối chứng dương là khoanh kháng sinh, đối chứng âm là nước cất.
2.5.2. Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán
- Nguyên lý: Kháng sinh ở trong khoang giấy khuếch tán vào thạch MHA có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính vịng kháng vô khuẩn xung quang giấy kháng sinh.
2.5.3. Phương pháp canh pha loãng Broth xác định giá trị MIC và MBC
Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration-MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum Bactericidal Concentration-MBC) là đại lượng định lượng tính nhạy cảm của một vi khuẩn phân lập đối với một kháng sinh nhất định. Như tên gọi đã thể hiện, MIC là nồng độ tối thiểu của một kháng sinh/mẫu vẫn có thể ngăn chặn sự phát triển của chủng vi khuẩn phân lập. Tương tự như vậy, MBC là nồng độ tối thiểu của một kháng sinh/mẫu dẫn tới giết chết vi khuẩn phân lập.
Phương pháp canh pha loãng Broth vận hành theo nguyên tắc tương tự, ngoại trừ kháng sinh được pha lỗng tốt hơn trong các mơi trường chất lỏng hơn trong môi trường thạch. Trong các thử nghiệm này, mơi trường với độ pha lỗng lớn nhất của một kháng sinh/mẫu mà vi khuẩn khơng phát triển thì đó chính là MIC. Hiện tại các phòng xét nghiệm vi sinh ở hầu hết các bệnh viện lớn đều sử dụng các máy dựa trên những nguyên tắc này để tự động kiểm tra hàng trăm chủng vi khuẩn phân lập.
Phần 3
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu
- Cây Mảnh cộng: Là các cá thể cây thu thập từ khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam (cây bản địa). Được lưu trữ tại vườn cây dược liệu của khoa CNSH – CNTP Đại học Nơng Lâm Thái Ngun với diện tích 100m2. Cây Mảnh cộng có tuổi đời 01 năm, cây sinh trưởng tốt, chưa ra hoa, khơng có sâu bệnh và được trồng dưới tán vườn.
Hình 3.1 Cây Mảnh cộng 3.1.2. Chủng vi sinh vật thử nghiệm 3.1.2. Chủng vi sinh vật thử nghiệm
Các chủng vi khuẩn dùng trong thí nghiệm có nguồn gốc tại Khoa Vi Sinh – Bệnh Viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên
- Chủng Pseudomonas aeruginosa
- Chủng Escherichia coli - Chủng Staphylococcus aureus - Chủng Proteus
- Chủng Klebsiella pneumoniae
3.1.3. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Thành phần môi trường MHA: - Dịch chiết thịt bò 2g
- Sản phẩm phân giải Casein 17,5g - Tinh bột 1,5g
- Agar 17g
Chuẩn bị mơi trường MHA:
Cân chính xác 38g bột môi trường MHA, hòa tan với 1000ml nước cất và khuấy đều. Đem môi trường vừa pha đi chuẩn độ pH, sử dụng máy đo pH để kiểm tra độ pH của môi trường và điều chỉnh độ pH khoảng 7,2 – 7,4 (có thể dùng HCL 1% hoặc NaOH 1% để điều chỉnh pH). Mang đi hấp môi trường ở nhiệt độ 121C trong 15 phút. Sau khi hấp xong, làm nguội mơi trường đến nhiệt độ phịng, đổ mơi trường vào 9 đĩa petri đã vô khuẩn với độ dày từ 3,5mm – 4,5mm. Các đĩa peptri phải đặt trên một mặt phẳng ngang và bằng để đảm bảo độ sâu của thạch ở mọi vị trí trong đĩa peptri bằng nhau.
3.1.4. Dụng cụ - thiết bị và hóa chất a. Thiết bị a. Thiết bị Bảng 3.1. Bảng danh sách thiết bị Thiết bị Số lượng Tủ sấy 1 Cân điện tử 1 Máy lắc 1 Máy đo pH 1 Tủ cấy vô trùng 1
Máy cô quay chân không 1
Nồi hấp tiệt trùng 1 Tủ ấm 1 b. Dụng cụ Bảng 3.2. Bảng danh sách dụng cụ Dụng cụ Số lượng Cối 1 Chày sứ 1 Đĩa peptri 9
Ống Falcon 1
Bình tam giác 100ml 2
Que cấy vi sinh tiệt trùng (đầu tròn) 9
Giấy lọc 10 Micropipet 1 Đèn cồn 1 c. Hóa chất Các hóa chất được sử dụng: - Cồn 70% - HCl 1% hoặc NaOH 1%
- Khoanh giấy kháng sinh : FOX, CAZ, TZP, AK