3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát khả năng kháng khuẩn từ dịch chiết cây
Clinacanthus nutans Burm.f Lindau.
Địa điểm: Khoa Vi Sinh - Bệnh viện Đa khoa TW Thái Nguyên. Thời gian: Từ 04/1/2021 đến 30/05/2021.
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 01: Nghiên cứu quy trình tách chiết dịch chiết từ cây Clinacanthus nutans Burm.f Lindau.
- Nội dung 02: Đánh giá khả năng kháng một số vi khuẩn từ dịch chiết cây
Clinacanthus nutans Burm.f Lindau.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Xử lí nguyên liệu
Cây Mảnh cộng (01 năm tuổi) lấy toàn bộ lá tươi, non và không bị sâu bệnh, nấm mốc. Đem đi rửa sạch, sấy mẫu ở mức nhiệt độ là 50°C trong vòng 30 phút cho đến khi mẫu khơ giịn, có khối lượng khơng đổi.
3.4.2. Phương pháp thu nhận dịch chiết
Phương pháp tách chiết tinh chất (crude extracts) từ mẫu thực vật được tiến hành như sau:
Nguyên liệu được thu hái, rửa sạch và sấy khơ giịn, sau đó nghiền nhỏ thành bột rồi cân chính xác. Mẫu bột khơ (g) và đong cồn 70% (ml) với tỉ lệ 1:20, được đựng vào bình tam giác 100ml. Lắc bằng máy lắc trong 14 tiếng ở nhiệt độ 30C. Lọc 2 - 3 lần và thu lại dung dịch mẫu. Sau đó cơ quay dung dịch mẫu và thu được cao chiết, đong 3 – 5 ml cồn 70% lắc đều bình chứa mẫu dung dịch để thu được cao chiết cịn sót lại trong bình. Đem sấy hỗn hợp cao chiết ở nhiệt độ 50C trong 24 tiếng để loại bỏ hoàn toàn cồn 70% còn lại trong hỗn hợp. Hòa tan cao chiết (g) thu được (sau khi loại bỏ hoàn toàn cồn 70%) vào nước cất (ml) và đựng bằng ống Falcon để chuẩn bị cho thí nghiệm kháng khuẩn.
3.4.3. Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn
a. Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch Tiến hành thí nghiệm:
Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Ria cấy vi khuẩn mỗi loại trên mặt thạch MHA đã khô ổn định (nồng độ tế bào 106 vi khuẩn/ ml), sau đó làm khơ trong tủ ấm khoảng 15 phút chờ khô bề mặt, đục lỗ giếng, nhỏ 200µl dung dịch dịch chiết vào giếng và đặt khoanh giấy kháng sinh đè nhẹ để đĩa giấy cố định trên mặt thạch (để ở nhiệt độ phòng 30 phút). Chuyển các đĩa petri vào tủ ấm và đọc kết quả đường kính vịng vơ khuẩn sau 16 - 18 giờ.
b. Nội dung phương pháp
Đem rửa sạch 9 đĩa petri và sau đó bọc giấy, đem sấy ở nhiệt độ 120C trong 2 tiếng. Pha môi trường thạch MHA- nước cất theo tỷ lệ 38g - 1000ml. Đem môi trường vừa pha đi đo và điều chỉnh độ pH 7,2 -7,4 (có thể dùng HCl 1% hoặc NaOH 1% để điều chỉnh pH), sử dụng máy đo pH để kiểm tra độ pH của môi trường MHA. Mang đi hấp môi trường ở nhiệt độ 121C trong 15 phút. Sau khi hấp xong, làm nguội mơi trường đến nhiệt độ phịng, đổ môi trường vào 9 đĩa petri đã vô khuẩn với độ dày từ 3,5mm – 4,5mm và để trong tủ ấm.
Các thao tác ria cấy vi khuẩn được thực hiện trong tủ cấy vô trùng và trên ngọn lửa đèn cồn, sử dụng que cấy vi sinh tiệt trùng ria cấy vi khuẩn mỗi loại (lấy trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm đã có kết quả kháng sinh đồ) trên mặt thạch MHA đã khô ổn định (nồng độ tế bào 106 vi khuẩn/ml), mỗi loại chủng khuẩn với 03 lần lặp. Sau đó làm khơ trong tủ ấm khoảng 15 phút chờ khô bề mặt, mỗi 1 đĩa petri đục 2 lỗ giếng, mỗi lỗ giếng có đường kính 8mm, chiều cao 4mm, sử dụng micropipet nhỏ 200µl dung dịch dịch chiết Mảnh cộng vào một giếng, giếng còn lại cũng sử dụng micropipet nhỏ 200µl nước cất, đặt khoanh giấy kháng sinh đè nhẹ để khoanh giấy cố định trên mặt thạch (để ở nhiệt độ phòng 30 phút). Sử dụng đối chứng âm là nước cất và đối chứng dương là khoanh giấy kháng sinh. Lật ngược đĩa, chuyển các đĩa petri vào tủ ấm và đọc kết quả đường kính vịng vơ khuẩn sau 16 - 18 giờ.
Đường kính vịng vơ khuẩn (D - d) được xác định bằng đường kính vịng kháng khuẩn ngồi trừ đi đường kính giếng thạch dịch chiết.
D : Đường kính vịng kháng khuẩn Giếng nước cất d : Đường kính giếng thạch dịch chiết Khoanh giấy kháng sinh Đĩa petri có sẵn mơi trường
và vi khuẩn