Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp đánh giá sự ổn định về số lượng của vi khuẩn B. subtillis
và G. thermophilus sau 12 tháng bảo tồn.
- Lấy ống vi khuẩn B. subtilis ra khỏi nơi bảo quản để ấm lên tự nhiên trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Lau bên ngoài ống chứa vi khuẩn bằng gạc vô trùng, đặc biệt là phần thân với vùng giữa nút. Dùng bơm tiêm đã vô trùng hút 1ml NaCl 0,9% cho vào ống vi khuẩn đã mở nắp ở điều kiện vô trùng và trộn đều.
- Từ các ống vi khuẩn đó ta tiến hành pha loãng, hút 1ml dịch huyền phù trong ống cho vào ống nghiệm vô trùng đã chứa 9ml NaCl 0,9%. Dùng pipet trộn đều bằng cách hút lên hút xuống 10 lần.
- Làm tương tự như trên pha loãng thành các nồng độ 10-2, 10-3, 10-4, 10- 5, 10-6, 10-7.
- Hút 0,05 ml mẫu cấy vào đĩa petri chứa môi trường TSA đã chuẩn bị sẵn, mỗi nồng độ pha loãng được cấy vào 3 đĩa petri đã hấp sấy vô trùng.
- Cấy xong cho vào tủ ấm, sau 24 giờ chúng ta quan sát và đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường TSA.
- Tính số lượng vi khuẩn:
Tổng số vi khuẩn(CFU/ml) = ∑
( . )
Trong đó:
C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ở hai độ pha loãng liên tiếp V: Thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa (ml)
n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được chọn để đếm số khuẩn lạc n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được chọn để đếm số khuẩn lạc d: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất
3.5.2. Phương pháp kiểm tra hình thái của vi khuẩn B. subtillis và G. thermophilus thermophilus
Sau khi cấy trên môi trường TSA/tủ ấm 37 độ/24h. Tiến hành lấy khuẩn lạc điển hình tiến hành làm tiêu bản nhuộm theo phương pháp nhuộm gram.
+ Cố định vi khuẩn B. subtilis và G. thermophilus bằng cách hơ trên ngọn lửa đền cồn.
+ Nhỏ lên tiêu bản một vài giọt thuốc nhuộm tím Gentian. Sau 1 phút rửa nước vẩy khô.
+ Nhỏ lên tiêu bản một vài giọt thuốc nhuộm lugol. Sau 1 phút, rửa nước vẩy khô.
+ Cho cồn actone chảy qua phiến kính phết vi khuẩn, rửa nước vẩy khô. + Nhỏ lên tiêu bản một vài giọt thuốc nhuộm fusin đỏ loãng, sau 1 phút rửa nước vẩy khô.
Sau khi nhuộm xong, vi khuẩn B. subtilis và G. thermophilus được tiến hành soi trên kính hiển vi. Qua kính hiển vi có thể quan sát thấy vi khuẩn
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích
thước 0,5 – 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8µm. G. thermophilus là một, Gram dương, kích thước 1.5-2.7/0.6-0.9 mm, bào tử vi khuẩn hình que, có thể phát triển hoặc đơn lẻ hoặc chuỗi, thường di chuyển được bằng roi peritrichous.
3.5.3. Kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của B.subtilis và G. thermophilus
Thực hiện các phản ứng sinh hóa: + Phản ứng catalaza
+ Phản ứng Indol + Lên men Glucose + Phản ứng Methyl Red + Phản ứng Voges Prokauer + Phản ứng Citrate
+ Lên men Manitol
Phản ứng Catalaza: Dùng que cấy lấy 1 ít khuẩn lạc phết lên phiến sạch, sau đó nhỏ vài giọt H2O2 3% lên khuẩn lạc.
Phản ứng dương tính: Sủi bọt
Phản ứng âm tính: không có hiện tượng sủi bọt Phản ứng Oxydaza
Thuốc thử: clohydrat hoặc oxalate dymethyl paraphenilin diamin pha với nước cất với nồng độ 1%. Để tủ lạnh 40C trước khi dùng.
Phương pháp thử: Dùng que cấy bạch kim lấy khuẩn lạc của loại vi khuẩn cần thử di trên miếng giấy đã thấm thuốc thử, Nhỏ 1 giọt thuốc thử ra giấy thấm vô trùng. Sau 10 giây nếu phản ứng dương tính sẽ hiện lên màu tím, nếu âm tính thì màu sắc không thay đổi.
Phản ứng Indol: Dung dịch thử Kovac:
Para dimetyl amino benzaldehyt 5 g
Cồn butylic hay cồn isoamylic 75 g
HCl đặc 25 g
Cho 5g Para dimetyl amino benzadehyt trộn vào cồn butylic để vào tủ ấm 50-600C, lắc đều cho tan hoàn toàn đợi nguội, cho HCL đặc vào từng giọt một, vừa cho vừa lắc.
Tiến hành phản ứng: Cấy vi khuẩn vào môi trường nước thịt và nuôi cấy ở 370c. Sau 1-2 ngày rồi lấy ra nhỏ vào môi trường nuôi cấy 3-4 giọt Kovac, lắc đều, nếu có indol sinh ra thì trên bề mặt môi trường có một vòng màu đỏ, đó là phản ứng dương tính. Nếu không biến màu là phản ứng âm tính, tức không có indol.
Phản ứng Methyl Red: Môi trường thử phản ứng: Pepton 7 g Glucoza 5 g Photphat dipotaxic (K2HP4) 5 g Nước cất 1000 ml
Hấp cách quãng 1000C cho tan hết, điều chỉnh pH =7,0- 7.2, lọc qua giấy, chia vào ống nghiệm, mỗi ống 10 ml hay 5ml. Hấp ướt 1100C trong 15 phút.
Chế dung dịch đỏ methyl:
Đỏ metyl 0,1 g
Cồn 950C 300 ml
Nước cất 200 ml
Tiến hành: Cấy vi khuẩn vào môi trường pepton glucoza, nuôi cấy trong tủ ấm 370C trong 2-4 ngày. Sau lấy ra nhỏ 2-3 giọt dung dịch đỏ metyl 0,04% trong
cồn 950C. Qua 5 phút nếu có màu đỏ là phản ứng dương tính, màu vàng là phản ứng âm tính, giữa màu đỏ và màu vàng là phản ứng khả nghi.
Phản ứng Voges Prokauer (VP): Môi trường thử phản ứng: Pepton 5g Glucoza 5g Photphat dipotaxic (K2HP4) 5g Nước cất 1000 ml
Hấp cách quãng 1000C cho tan hết, điều chỉnh pH =7,5, lọc qua giấy, chia vào ống nghiệm, mỗi ống 10 ml hay 5ml. Hấp ướt 1100C trong 15 phút.
Chế dung dịch thử phản ứng V.P:
Dung dịch 1: Alpha naphtol 5g
Cồn 960 100 ml
Dung dịch 2: NAOH 40g
Nước cất 100 ml
Phương pháp tiến hành: cấy giống vi khuẩn cần chẩn đoán vào môi trường pepton glucoza, nuôi cấy ở nhiệt độ 370C trong 2-4 ngày, sau đó nhỏ vào môi trường nuôi cấy trên 5 giọt dung dịch 1 và 2, sau 5 phút nếu có màu đỏ hồng là dương tính, biến màu hoặc màu vàng là âm tính, loại phản ứng này có khi 4-5 giờ sau mới xuất hiện
- Xác định đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn B. subtilis và
G. themophilus theo phương pháp mô tả trong phòng thí nghiệm:
+ Mở ống giống vi khuẩn B. subtilis và G. thermophilus tiến hành cấy trên môi trường thạch nghiêng TSA
+ Sau khi kiểm tra thấy vi khuẩn B. subtilis mọc trên môi trường thạch nghiêng TSA có khuẩn lạc màu xám nhạt, rìa nhăn gợn sóng, xù xù, bề mặt khô. Vi khuẩn G. thermophilus mọc trên môi trường thạch nghiêng TSA có khuẩn lạc màu xám nhạt, trơn bề mặt khô. Thì ta lấy 1 khuẩn lạc đặc trưng cấy lên trên môi trường thạch khoai tây, gelatin, TSA nuôi trong tủ ấm ở 37ºC trong 24 giờ.
+ Sau 24 giờ nuôi cấy đem quan sát tính chất mọc của vi khuẩn B. subtilis và G thermophilus trên môi trường thạch khoai tây, genlatin, TSA.
+ Tiếp tục lấy khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường trên để nhuộm Gram quan sát đặc điểm hình thái, thử các phản ứng sinh hóa như Lecithilase, TSI, VP, MR, Indol, catalase, manitol (bán cổ thể), khả năng lên men các loại đường.
3.5.4. Phương pháp kiểm tra ô nhiễm nấm của các chủng vi khuẩn B.
subtillis và G. thermophilus sau bảo tồn bằng phương pháp đông khô
Pha loãng mẫu sau đó cấy vào môi trường Sabouraul nuôi cấy trong tủ ấm 37ºC trong 7 ngày để đọc kết quả.
3.5.5. Phương pháp xử lý số liệu