3.3.1. Môi trường, hóa chất
- Sử dụng các loại môi trường đặc trưng của hang Merk, Đức : TSA, BHI
- Nước sinh lí 0,9% - Thạch khoai tây
- Thuốc Thử Melthyl Red - Thuốc thử Kovacs
- Sử dụng các loại hóa chất: H2SO4 , NaCl 0.9%, NaOH, HCl, H2O2
3.3.2. Trang thiết bị
Các máy móc thông dụng trong phòng thí nghiệm Bộ môn Thú y cộng đồng, Khoa Thú y: máy khuấy từ gia nhiệt, nồi hấp ướt, tủ sấy, kính đếm khuẩn lạc, buồng cấy, tủ lạnh, tủ ấm.
3.3.3. Vi khuẩn
Các ống vi khuẩn B. subtilis, G. thermophilus đã được bảo tồn đủ 12 tháng trước khi tiến hành nghiên cứu tại phòng thí nghiêm Bộ môn Thú y cộng đồng, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Đánh giá sự ổn định về số lượng của B. subtilis và G. thermophilus
- Kiểm tra đặc điểm hình thái - Kiểm tra đặc tính nuôi cấy - Kiểm tra đặc tính sinh hóa - Kiểm tra sự ô nhiễm nấm
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp đánh giá sự ổn định về số lượng của vi khuẩn B. subtillis
và G. thermophilus sau 12 tháng bảo tồn.
- Lấy ống vi khuẩn B. subtilis ra khỏi nơi bảo quản để ấm lên tự nhiên trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Lau bên ngoài ống chứa vi khuẩn bằng gạc vô trùng, đặc biệt là phần thân với vùng giữa nút. Dùng bơm tiêm đã vô trùng hút 1ml NaCl 0,9% cho vào ống vi khuẩn đã mở nắp ở điều kiện vô trùng và trộn đều.
- Từ các ống vi khuẩn đó ta tiến hành pha loãng, hút 1ml dịch huyền phù trong ống cho vào ống nghiệm vô trùng đã chứa 9ml NaCl 0,9%. Dùng pipet trộn đều bằng cách hút lên hút xuống 10 lần.
- Làm tương tự như trên pha loãng thành các nồng độ 10-2, 10-3, 10-4, 10- 5, 10-6, 10-7.
- Hút 0,05 ml mẫu cấy vào đĩa petri chứa môi trường TSA đã chuẩn bị sẵn, mỗi nồng độ pha loãng được cấy vào 3 đĩa petri đã hấp sấy vô trùng.
- Cấy xong cho vào tủ ấm, sau 24 giờ chúng ta quan sát và đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường TSA.
- Tính số lượng vi khuẩn:
Tổng số vi khuẩn(CFU/ml) = ∑
( . )
Trong đó:
C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ở hai độ pha loãng liên tiếp V: Thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa (ml)
n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được chọn để đếm số khuẩn lạc n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được chọn để đếm số khuẩn lạc d: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất
3.5.2. Phương pháp kiểm tra hình thái của vi khuẩn B. subtillis và G. thermophilus thermophilus
Sau khi cấy trên môi trường TSA/tủ ấm 37 độ/24h. Tiến hành lấy khuẩn lạc điển hình tiến hành làm tiêu bản nhuộm theo phương pháp nhuộm gram.
+ Cố định vi khuẩn B. subtilis và G. thermophilus bằng cách hơ trên ngọn lửa đền cồn.
+ Nhỏ lên tiêu bản một vài giọt thuốc nhuộm tím Gentian. Sau 1 phút rửa nước vẩy khô.
+ Nhỏ lên tiêu bản một vài giọt thuốc nhuộm lugol. Sau 1 phút, rửa nước vẩy khô.
+ Cho cồn actone chảy qua phiến kính phết vi khuẩn, rửa nước vẩy khô. + Nhỏ lên tiêu bản một vài giọt thuốc nhuộm fusin đỏ loãng, sau 1 phút rửa nước vẩy khô.
Sau khi nhuộm xong, vi khuẩn B. subtilis và G. thermophilus được tiến hành soi trên kính hiển vi. Qua kính hiển vi có thể quan sát thấy vi khuẩn
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích
thước 0,5 – 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8µm. G. thermophilus là một, Gram dương, kích thước 1.5-2.7/0.6-0.9 mm, bào tử vi khuẩn hình que, có thể phát triển hoặc đơn lẻ hoặc chuỗi, thường di chuyển được bằng roi peritrichous.
3.5.3. Kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của B.subtilis và G. thermophilus
Thực hiện các phản ứng sinh hóa: + Phản ứng catalaza
+ Phản ứng Indol + Lên men Glucose + Phản ứng Methyl Red + Phản ứng Voges Prokauer + Phản ứng Citrate
+ Lên men Manitol
Phản ứng Catalaza: Dùng que cấy lấy 1 ít khuẩn lạc phết lên phiến sạch, sau đó nhỏ vài giọt H2O2 3% lên khuẩn lạc.
Phản ứng dương tính: Sủi bọt
Phản ứng âm tính: không có hiện tượng sủi bọt Phản ứng Oxydaza
Thuốc thử: clohydrat hoặc oxalate dymethyl paraphenilin diamin pha với nước cất với nồng độ 1%. Để tủ lạnh 40C trước khi dùng.
Phương pháp thử: Dùng que cấy bạch kim lấy khuẩn lạc của loại vi khuẩn cần thử di trên miếng giấy đã thấm thuốc thử, Nhỏ 1 giọt thuốc thử ra giấy thấm vô trùng. Sau 10 giây nếu phản ứng dương tính sẽ hiện lên màu tím, nếu âm tính thì màu sắc không thay đổi.
Phản ứng Indol: Dung dịch thử Kovac:
Para dimetyl amino benzaldehyt 5 g
Cồn butylic hay cồn isoamylic 75 g
HCl đặc 25 g
Cho 5g Para dimetyl amino benzadehyt trộn vào cồn butylic để vào tủ ấm 50-600C, lắc đều cho tan hoàn toàn đợi nguội, cho HCL đặc vào từng giọt một, vừa cho vừa lắc.
Tiến hành phản ứng: Cấy vi khuẩn vào môi trường nước thịt và nuôi cấy ở 370c. Sau 1-2 ngày rồi lấy ra nhỏ vào môi trường nuôi cấy 3-4 giọt Kovac, lắc đều, nếu có indol sinh ra thì trên bề mặt môi trường có một vòng màu đỏ, đó là phản ứng dương tính. Nếu không biến màu là phản ứng âm tính, tức không có indol.
Phản ứng Methyl Red: Môi trường thử phản ứng: Pepton 7 g Glucoza 5 g Photphat dipotaxic (K2HP4) 5 g Nước cất 1000 ml
Hấp cách quãng 1000C cho tan hết, điều chỉnh pH =7,0- 7.2, lọc qua giấy, chia vào ống nghiệm, mỗi ống 10 ml hay 5ml. Hấp ướt 1100C trong 15 phút.
Chế dung dịch đỏ methyl:
Đỏ metyl 0,1 g
Cồn 950C 300 ml
Nước cất 200 ml
Tiến hành: Cấy vi khuẩn vào môi trường pepton glucoza, nuôi cấy trong tủ ấm 370C trong 2-4 ngày. Sau lấy ra nhỏ 2-3 giọt dung dịch đỏ metyl 0,04% trong
cồn 950C. Qua 5 phút nếu có màu đỏ là phản ứng dương tính, màu vàng là phản ứng âm tính, giữa màu đỏ và màu vàng là phản ứng khả nghi.
Phản ứng Voges Prokauer (VP): Môi trường thử phản ứng: Pepton 5g Glucoza 5g Photphat dipotaxic (K2HP4) 5g Nước cất 1000 ml
Hấp cách quãng 1000C cho tan hết, điều chỉnh pH =7,5, lọc qua giấy, chia vào ống nghiệm, mỗi ống 10 ml hay 5ml. Hấp ướt 1100C trong 15 phút.
Chế dung dịch thử phản ứng V.P:
Dung dịch 1: Alpha naphtol 5g
Cồn 960 100 ml
Dung dịch 2: NAOH 40g
Nước cất 100 ml
Phương pháp tiến hành: cấy giống vi khuẩn cần chẩn đoán vào môi trường pepton glucoza, nuôi cấy ở nhiệt độ 370C trong 2-4 ngày, sau đó nhỏ vào môi trường nuôi cấy trên 5 giọt dung dịch 1 và 2, sau 5 phút nếu có màu đỏ hồng là dương tính, biến màu hoặc màu vàng là âm tính, loại phản ứng này có khi 4-5 giờ sau mới xuất hiện
- Xác định đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn B. subtilis và
G. themophilus theo phương pháp mô tả trong phòng thí nghiệm:
+ Mở ống giống vi khuẩn B. subtilis và G. thermophilus tiến hành cấy trên môi trường thạch nghiêng TSA
+ Sau khi kiểm tra thấy vi khuẩn B. subtilis mọc trên môi trường thạch nghiêng TSA có khuẩn lạc màu xám nhạt, rìa nhăn gợn sóng, xù xù, bề mặt khô. Vi khuẩn G. thermophilus mọc trên môi trường thạch nghiêng TSA có khuẩn lạc màu xám nhạt, trơn bề mặt khô. Thì ta lấy 1 khuẩn lạc đặc trưng cấy lên trên môi trường thạch khoai tây, gelatin, TSA nuôi trong tủ ấm ở 37ºC trong 24 giờ.
+ Sau 24 giờ nuôi cấy đem quan sát tính chất mọc của vi khuẩn B. subtilis và G thermophilus trên môi trường thạch khoai tây, genlatin, TSA.
+ Tiếp tục lấy khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường trên để nhuộm Gram quan sát đặc điểm hình thái, thử các phản ứng sinh hóa như Lecithilase, TSI, VP, MR, Indol, catalase, manitol (bán cổ thể), khả năng lên men các loại đường.
3.5.4. Phương pháp kiểm tra ô nhiễm nấm của các chủng vi khuẩn B.
subtillis và G. thermophilus sau bảo tồn bằng phương pháp đông khô
Pha loãng mẫu sau đó cấy vào môi trường Sabouraul nuôi cấy trong tủ ấm 37ºC trong 7 ngày để đọc kết quả.
3.5.5. Phương pháp xử lý số liệu
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ KIỂM TRA TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA VI KHUẨN B. SUBTILIS, G. THERMOPHILUS SUBTILIS, G. THERMOPHILUS
4.1.1. Kết quả kiểm tra về số lượng của vi khuẩn B. subtilis, G. thermophi lus
sau bảo tồn đông khô và môi trường trên cát
Sau khi tiến hành kiểm tra số lượng của vi khuẩn B. subtilis ở 50 ống giống vi khuẩn và 50 ống giống vi khuẩn G. thermophilus được bảo quản bằng phương pháp đông khô thu được kết quả sau:
Bảng 4.1. Số lượng của vi khuẩn B. subtilis, G. thermophilus
sau 12 tháng bảo quản đông khô
Chủng vi khuẩn N
Số lượng vi khuẩn trước khi bảo quản
(CFU/ml)
Số lượng vi khuẩn sau 12 tháng bảo quản (CFU/g) Tỷ lệ sống (%) B. Subtilis 50 4,9×107 4,3×107 87,76 G. thermophilus 50 2,3x108 1,9×108 82,61
Bảng 4.2. Số lượng của vi khuẩn B. subtilis, G. thermophilus
sau 12 tháng bảo quản trên môi trường cát
Chủng vi khuẩn N
Số lượng vi khuẩn trước khi bảo quản
(CFU/ml) Số lượng vi khuẩn sau 12 tháng bảo quản (CFU/g) Tỷ lệ sống (%) B. Subtilis 50 6,2×107 4,6×107 74,19 G. thermophilus 50 2,5x108 1,7×108 68,00
Kết quả kiểm tra số lượng của vi khuẩn trên Bảng 4.1 cho thấy:
Khi kiểm tra 50 ống giống B. subtilis và 50 ống giống G. thermophilus sau khi bảo quản đông khô 12 tháng trên tỷ lệ sống của vi khuẩn B. subtilis và G. thermophilus lần lượt là 87,76% và 82,61%.
Kiểm tra 50 ống giống B. subtilis và 50 ống giống G. thermophilus sau 12 tháng bảo quản trên cát, tỷ lệ sống của 2 chủng vi khuẩn này lần lượt là 71,19% và 68%.
pháp bảo quản giữ được số lượng vi khuẩn B. subtilis, G. thermophilus. Phương pháp bảo quản ở môi trường đông khô có nhiều ưu điểm như: Bảo quản được trong thời gian dài. Ít bị tạp, hạn chế sự thay đổi các đặc tính của vi khuẩn này vì vậy hạn chế mất chủng giống gốc. Phương pháp bảo quản trong cát có tỷ lệ sống thấp hơn so với phương pháp đông khô, tuy nhiên phương pháp này có ưu điểm là đơn giản , chi phí thấp, không yêu cầu máy móc và các trang thiết bị hiện đại.
4.1.2. Kết quả kiểm tra sự ổn dịnh về đặc điểm hình thái, đặc tính nuôi cấy và đặc tính sinh hóa của vi khuẩn B. subtilis, G. thermophilus sau bảo quản và đặc tính sinh hóa của vi khuẩn B. subtilis, G. thermophilus sau bảo quản
a. Đặc điểm hình thái
Sau khi nhuộm vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram, tiến hành soi trên kính hiển vi điện tử ta thấy:
B. subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu Gram (+), đứng đơn lẻ hay thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn này có khả năng sinh nha bào và không làm biến đổi hình dạng vi khuẩn.
G. Stearothermophilus là trực khuẩn có dạng hình que, có thể đứng riêng rẽ hoặc thành chuỗi. Bắt màu Gram (+) khi nhuộm.
Hình 4.1. Hình thái của vi khuẩn
G. thermophilus
Hình 4.2. Hình thái của vi khuẩn
B. subtilis
b. Đặc tính nuôi cấy
Chúng tôi tiến hành lấy 50 ống giống B. subtilis và 50 ống giống
G. themophilus đang được lưu giữ tiến hành kiểm tra đặc điểm nuôi cấy (trong mỗi ống giống được kiểm tra có 25 ống giống B. subtilis, 25 ống giống của
G. themophilus được bảo quản trên môi trường cát. 25 ống giống B. subtilis, 25 ống giống G. thermophilus được bảo quản đông khô).
Hình 4.3. Khuẩn lạc vi khuẩn B. subtilis
trên môi trường TSA
Hình 4.4. Khuẩn lạc vi khuẩn G.
thermophilus trên môi trường
TSA
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra một số đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn B. subtilis
sau thời gian bảo tồn
Môi trường kiểm tra
Số ống kiểm
tra
Đặc tính nuôi cấy sinh học
của B. subtilis Số ống biểu hiện đặc tính Tỷ lệ (%) Thạch đĩa TSA 50
Khuẩn lạc có dạng hình tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, phát triển chậm, màu váng xám.
50 100 Thạch
nghiêng TSA 50
Dễ mọc, khuẩn lạc màu xám nhạt, rìa
gợn sóng xù xì, bề mặt khô. 50 100 Thạch khoai
tây 50
Phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt
50 100
Môi trường
TSI 50
Cả phần đáy môi trường chuyển sang màu vàng, mặt nghiêng của thạch chuyển sang màu hồng đậm, không sinh hơi
50 100
Nước thịt 50
Tạo màng nhăn, lắng cặn kết như vẩn
Bảng 4.4. Kết quả kiểm tra một số đặc tính của vi khuẩn G. thermophilus
sau thời gian bảo tồn
Môi trường
kiểm tra kiểm tra Số ống Đặc tính nuôi cấy sinh học của G. Stearothermophilus
Số ống biểu hiện đặc tính Tỷ lệ (%) Thạch nghiêng
TSA 50 Xuất hện những khuẩn lạc màu xám nhạt, 50 100 Thạch đĩa TSA 50 Xuất hiện những khuẩn lạc
dạng tròn 50 100 Thạch khoai tây 50 Khuẩn lạc có màu vàng, khi
cấy theo đường ziczac thì khuẩn lạc mọc lan rộng như cành cây khô
50 100
Genlatin 50 50 100
TSI 50 Cả phần đáy môi trường chuyển sang màu vàng, mặt nghiêng của thạch chuyển sang màu hồng đậm, không sinh hơi
50 100
Nước thịt 50 Làm đục môi trường nươc thịt, lắng cặn như ẩn mây khi lắc khó tan đều
50 100
Từ bảng 4.3 và 4.4 ta thấy với 50 chủng B. subtilis và 50 chủng G. thermophilus sau thời gian bảo quản, đặc tính nuôi cấy giống với khuẩn lạc đặc trưng.
Hình 4.5. Vi khuẩn B. subtilis trên thạch nghiêng TSA
Hình 4.6. Vi khuẩn G. thermophilus trên thạch nghiêng TSA
Hình 4.7. Vi khuẩn B. subtilis phát triển làm đục môi trường nước thịt
Hình 4.8. Vi khuẩn B. subtilis trên môi trường thạch khoai tây
c. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn B. Subtilis, G. thermophilus sau thời gian bảo tồn
Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng vi khuẩn sau 12 tháng bảo quản cũng phù hợp với kết quả khi thực hiện với đối chứng dương là các chủng giống thuần chủng từ Bảo tàng thuần chủng Việt Nam.
Kết quả này phù hợp với kết quả của các tác giả khác (Holt et al., 1994; Green et al., 1999; O’Donnell et al., 1980).
Trong mỗi ống giống được kiểm tra có 25 ống giống B. Subtilis, 25 ống giống của G. thermophilus được bảo quản trên môi trường cát. 25 ống giống B. subtilis, 25 ống giống G. thermophilus được bảo quản đông khô
Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn B. subtilis sau thời gian 12 tháng bảo tồn
Đặc tính sinh hóa Số mẫu
kiểm tra Kết quả Số mẫu
Tỷ lệ (%) Sinh Indole 50 - 50 100 MR 50 + 50 100 VP 50 + 50 100 Catalase 50 + 50 100 Di động 50 + 50 100
Tan chảy Genlatin 50 + 50 100 Lên men glucose 50 + 50 100 Lên men lactose 50 - 50 100 Lên men saccharose 50 + 50 100
Bảng 4.6. Kết quả kiểm tra một số đặc tính của vi khuẩn G. thermophilus
sau thời gian bảo tồn
Đặc tính sinh hóa Số mẫu
kiểm tra Kết quả Số mẫu
Tỷ lệ (%) Sinh Indole 50 - 50 100 MR 50 + 50 100 VP 50 + 50 100 Catalase 50 + 50 100 Di động 50 + 50 100 Tan chảy Genlatin 50 + 50 100 Lên men glucose 50 + 50 100 Lên men lactose 50 - 50 100 Lên men saccharose 50 + 50 100
Từ bảng 4.5 và 4.6 ta thấy:
Hầu hết các chủng B. subtilis và G. thermophilus đều dương tính với MR, khử nitrate, âm tính với phản ứng Idol. Các chủng B. Subtilis và
G. themophilus đề có khả năng di động. Kết quả kiểm tra cũng phù hợp với kết quả thự hiện với đối chứng dương là các chủng gống thuần chủng từ bảo tàng giống Việt Nam.
Hình 4.9. Phản ứng catalase của vi khuẩn B. subtilis, G. thermophilus