trên môi trường TSA
Hình 4.4. Khuẩn lạc vi khuẩn G.
thermophilus trên môi trường
TSA
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra một số đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn B. subtilis
sau thời gian bảo tồn
Môi trường kiểm tra
Số ống kiểm
tra
Đặc tính nuôi cấy sinh học
của B. subtilis Số ống biểu hiện đặc tính Tỷ lệ (%) Thạch đĩa TSA 50
Khuẩn lạc có dạng hình tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, phát triển chậm, màu váng xám.
50 100 Thạch
nghiêng TSA 50
Dễ mọc, khuẩn lạc màu xám nhạt, rìa
gợn sóng xù xì, bề mặt khô. 50 100 Thạch khoai
tây 50
Phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt
50 100
Môi trường
TSI 50
Cả phần đáy môi trường chuyển sang màu vàng, mặt nghiêng của thạch chuyển sang màu hồng đậm, không sinh hơi
50 100
Nước thịt 50
Tạo màng nhăn, lắng cặn kết như vẩn
Bảng 4.4. Kết quả kiểm tra một số đặc tính của vi khuẩn G. thermophilus
sau thời gian bảo tồn
Môi trường
kiểm tra kiểm tra Số ống Đặc tính nuôi cấy sinh học của G. Stearothermophilus
Số ống biểu hiện đặc tính Tỷ lệ (%) Thạch nghiêng
TSA 50 Xuất hện những khuẩn lạc màu xám nhạt, 50 100 Thạch đĩa TSA 50 Xuất hiện những khuẩn lạc
dạng tròn 50 100 Thạch khoai tây 50 Khuẩn lạc có màu vàng, khi
cấy theo đường ziczac thì khuẩn lạc mọc lan rộng như cành cây khô
50 100
Genlatin 50 50 100
TSI 50 Cả phần đáy môi trường chuyển sang màu vàng, mặt nghiêng của thạch chuyển sang màu hồng đậm, không sinh hơi
50 100
Nước thịt 50 Làm đục môi trường nươc thịt, lắng cặn như ẩn mây khi lắc khó tan đều
50 100
Từ bảng 4.3 và 4.4 ta thấy với 50 chủng B. subtilis và 50 chủng G. thermophilus sau thời gian bảo quản, đặc tính nuôi cấy giống với khuẩn lạc đặc trưng.
Hình 4.5. Vi khuẩn B. subtilis trên thạch nghiêng TSA thạch nghiêng TSA
Hình 4.6. Vi khuẩn G. thermophilus trên thạch nghiêng TSA thạch nghiêng TSA
Hình 4.7. Vi khuẩn B. subtilis phát triển làm đục môi trường nước thịt triển làm đục môi trường nước thịt
Hình 4.8. Vi khuẩn B. subtilis trên môi trường thạch khoai tây trường thạch khoai tây
c. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn B. Subtilis, G. thermophilus sau thời gian bảo tồn
Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng vi khuẩn sau 12 tháng bảo quản cũng phù hợp với kết quả khi thực hiện với đối chứng dương là các chủng giống thuần chủng từ Bảo tàng thuần chủng Việt Nam.
Kết quả này phù hợp với kết quả của các tác giả khác (Holt et al., 1994; Green et al., 1999; O’Donnell et al., 1980).
Trong mỗi ống giống được kiểm tra có 25 ống giống B. Subtilis, 25 ống giống của G. thermophilus được bảo quản trên môi trường cát. 25 ống giống B. subtilis, 25 ống giống G. thermophilus được bảo quản đông khô
Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn B. subtilis sau thời gian 12 tháng bảo tồn
Đặc tính sinh hóa Số mẫu
kiểm tra Kết quả Số mẫu
Tỷ lệ (%) Sinh Indole 50 - 50 100 MR 50 + 50 100 VP 50 + 50 100 Catalase 50 + 50 100 Di động 50 + 50 100
Tan chảy Genlatin 50 + 50 100 Lên men glucose 50 + 50 100 Lên men lactose 50 - 50 100 Lên men saccharose 50 + 50 100
Bảng 4.6. Kết quả kiểm tra một số đặc tính của vi khuẩn G. thermophilus
sau thời gian bảo tồn
Đặc tính sinh hóa Số mẫu
kiểm tra Kết quả Số mẫu
Tỷ lệ (%) Sinh Indole 50 - 50 100 MR 50 + 50 100 VP 50 + 50 100 Catalase 50 + 50 100 Di động 50 + 50 100 Tan chảy Genlatin 50 + 50 100 Lên men glucose 50 + 50 100 Lên men lactose 50 - 50 100 Lên men saccharose 50 + 50 100
Từ bảng 4.5 và 4.6 ta thấy:
Hầu hết các chủng B. subtilis và G. thermophilus đều dương tính với MR, khử nitrate, âm tính với phản ứng Idol. Các chủng B. Subtilis và
G. themophilus đề có khả năng di động. Kết quả kiểm tra cũng phù hợp với kết quả thự hiện với đối chứng dương là các chủng gống thuần chủng từ bảo tàng giống Việt Nam.
Hình 4.9. Phản ứng catalase của vi khuẩn B. subtilis, G. thermophilus
4.1.3 Kết quả kiểm tra ô nhiễm nấm sau thời gian bảo tồn
Tiến hành nuôi cấy 50 ống giống B. subtilis, 50 ống giống của G. ther mophilus được bảo quản trên môi trường cát. 50 ống giống B. subtilis, 50 ống giống G. thermophilus được bảo quản đông khô trên môi trường Sabouraul ở nhiệt dộ 37°C sau 24h, 48h, 72h mang ra quan sát.
Kết quả thu được như sau:
Kết quả trên ta thấy tỉ lệ nhiễm nấm của các ống giống được bảo quản trong môi trường đông khô và trong cát không nhiễm, điều này cho thấy thêm ưu điểm của việc bảo quản các ống giống trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp đông khô và trong cát.
Bảng 4.7. Kết quả kiểm tra ô nhiễm nấm của vi khuẩn B. subtilis, G. thermo
philus sau thời gian bảo tồn
Môi trường bảo quản
Số mẫu kiểm tra
Vi khuẩn B. subtilis Vi khuẩn G. thermophilus
Số mẫu (+) Tỉ lệ (%) Số mẫu (+) Tỉ lệ (%)
Đông khô 50 0 0% 0 0% Trong cát 50 0 0% 0 0%
Kết quả trên ta thấy tỉ lệ nhiễm nấm của các ống giống được bảo quản trong môi trường đông khô không nhiễm, điều này cho thấy thêm ưu điểm của việc bảo quản các ống giống trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp đông khô và trong cát.
4.1.4. Kết quả kiểm tra tính đối kháng của B. subtilis và G. thermophilus với vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn gây bệnh
Chúng tôi tiến hành kiểm tra tính đối kháng của B. subtilis và G. thermophilus với 2 chủng vi khuẩn E.coli gây tiêu chảy Enterotoxigenic E.coli
(chủng PD17) và Enterotoxigenic E.coli (chủng TM21) bằng phương pháp đục lỗ thạch. Môi trường TSA được tiến hành đục lỗ bằng nút cao su đường kính 10mm, sau đó tiến hành láng vi khuẩn E.coli lên bề mặt thạch, hút 50 μl dung dịch chứa vi khuẩn bacillus bơm vào các lỗ trên đĩa thạch. Ủ các đĩa thạch trong tủ ấm và quan sát vòng vô khuẩn sau 24 giờ.
Kích thước vòng đối kháng = đường kính vòng kháng khuẩn - đường kính lỗ chứa dịch chiết vi khuẩn đối kháng
Bảng 4.8. Kết quả kiểm tra tính đối kháng của B. subtilis và G. thermophilus
với vi khuẩn Enterotoxigenic (chủng PD17) và Enterotoxigenic (chủng TM21)
Chủng vi khuẩn Enterotoxigenic E.coli (chủng PD17)
Enterotoxigenic E.coli
(chủng TM21)
B. subtilis Vòng đối kháng 25mm Vòng đối kháng 28mm
G. themophilus Vòng đối kháng 30mm Vòng đối kháng 26mm
Kết quả kiểm tra cho thấy B. subtilis và G. thermophilus có tính đối kháng mạnh với Enterotoxigenic (chủng PD17) và Enterotoxigenic (chủng TM21)
Vậy, đối kháng của vi khuẩn B. subtilis và G. thermophilus với chủng E. Coli gây bệnh chủng PD17 và chủng TM21 đều > 20 mm. Điều này chứng tỏ
B. subtilis và G. thermophilus đang bảo tồn có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn này.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
Từ những kết quả đánh giá sự ổn định của B. subtilis và G. thermophilus sau thời gian bảo tồn, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:
Môi trường bảo quản đông khô và bảo quản trên cát giữ được số lượng, tỷ lệ sống của vi khuẩn B. subtilis, G. thermophilus. Cụ thể, tỷ lệ sống của vi khuẩn B. subtilis và G. thermophilus sau khi bảo quản 12 tháng ở môi trường đôg khô lần lượt là 87,76% và 82,61%; bảo quản trên cát lần lượt là 71,19% và 68%.
Môi trường bảo quản đông khô và bảo quản trong cát giữ được sự ổn định về đặc điểm hình thái, đặc tính nuôi cấy và đặc tính sinh hóa của vi khuẩn B. subtilis, G. thermophilus sau thời gian bảo quản 12 tháng.
Sau thời gian bảo quản 12 tháng trong môi trường đông khô và bảo quản trên cát, vi khuẩn B. Subtilis, G. Thermophilus không bị nhiễm nấm.
B. subtilis và G. thermophilus có khả năng ức chế Enterotoxigenic (chủng PD17) và Enterotoxigenic (chủng TM21).
5.2. KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục bảo quản, lưu giữ vi khuẩn B. subtilis và G. themophilus theo phương pháp bảo quản trong cát, đông khô. Đây là phương pháp thích hợp, dễ thực hiện đặc biệt phù hợp với phòng thí nghiệm bộ môn Thú y cộng đồng.
2. Tiếp tục thu thập thêm các chủng vi khuẩn mới để bảo tồn phục vụ công tác nghiên cứu và giảng dậy.
3. Cần có thêm thời gian để đánh giá thêm các chỉ tiêu của chủng bảo quản để thực sự kiểm tra được chất lượng của chủng sau bảo quản tốt nhất trong điều kiện phòng thí nghiệm của bộ môn..
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng Việt:
1. Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp và Nguyễn Thị Kim Chi (2004). Nghiên cứu một số đặc tính sinh hóa của các chủng Bacillus subtilis dùng trong sản xuất sinh phẩm. Tạp chí Y học thực hành. (478).
2. Lương Đức Phẩm (1998). Công nghệ vi sinh vật. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 3. Lý Kim Hữu (2005). Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu
điều kiện nuôi cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm propiotic. LVTN. Khoa chăn nuôi - thú y, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh.
4. Nguyễn Duy Khánh (2006). Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi khuẩn
Bacillus subtilis. LVTN. Khoa công nghệ sinh học, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh.
5. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến và Phạm Văn Ty (1998). Vi sinh vật học. NXB Giáo dục, Hà Nội.
6. Nguyễn Như Thanh (1990). Vi sinh vật đại cương. NXB Giáo dục, Hà Nội. 7. Nguyễn Thị Thu Hằng, Nguyễn Viết Không, Phạm Sơn Hổ, Phạm Thị Nga, Lê
Văn Hùng, Hồ Văn Hiệp và Đỗ Văn Tấn (2013). Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen vi sinh vật thú y. Báo cáo nhiệm vụ bảo tồn quỹ gen, Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn.
8. Nguyễn Thị Trang và Phạm Hồng Ngân (2017). Lưu giữ và bảo quản nguồn gen nông nghiệp nhập nội phục vụ công tác nghiên cứu, đào tạo và đa dạng sinh học. Báo cáo nhiệm vụ bảo tồn quỹ gen, Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn 9. Tô Minh Châu, Vương Thị Việt Nga, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn
Thị Ngọc Diệp và Nguyễn Thúy Hương (2000). Vi sinh vật học đại cương. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
10. Vũ Thị Thứ (1996). Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của một số vi khuẩn thuộc chi Bacillus subtilis. Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học. Viện sinh học nhiệt đới.
II. Tài liệu tiếng Anh:
1. Alexander M. (1977). Introduction to Soil Microbiology. John Wiley and Són, Inc., New York.
2. Hetzer A. (2006). Cadmium Ion Biosorption by the Thermophilic Bacteria
Geobacillus thermophilus and G. Thermocatenulatus. Applied and environmental Microbio logy. pp. 4020-4027.
3. Holt J. G., N. R. Krieg, P.H.A. Sneath, J. T. Staley and S.T. William (1994). Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th Baltimore: William & Wilkins. 4. Microbial Biorealm (2011). Bacillus thermophilus.
5. O’Donnell A.G., J.R. Norris, R.C.W. Berkeley, D. Claus, T. Kanero, N.A. Logan and R. Nozaki (1980). Characterization of Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, and Bacillus amyloliquefac ciens by pyrolisis gas-liquid chromatography, deoxyribonucleic acid-deoxyribonucleic acid hybridization, biochemical test, and API systems. Internat. J.Syst. Bacteriol. 30. pp. 448-459.