- Lấy ống vi khuẩn B. subtilis ra khỏi nơi bảo quản để ấm lên tự nhiên trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Lau bên ngoài ống chứa vi khuẩn bằng gạc vô trùng, đặc biệt là phần thân với vùng giữa nút. Dùng bơm tiêm đã vô trùng hút 1ml NaCl 0,9% cho vào ống vi khuẩn đã mở nắp ở điều kiện vô trùng và trộn đều.
- Từ các ống vi khuẩn đó ta tiến hành pha loãng, hút 1ml dịch huyền phù trong ống cho vào ống nghiệm vô trùng đã chứa 9ml NaCl 0,9%. Dùng pipet trộn đều bằng cách hút lên hút xuống 10 lần.
- Làm tương tự như trên pha loãng thành các nồng độ 10-2, 10-3, 10-4, 10- 5, 10-6, 10-7.
- Hút 0,05 ml mẫu cấy vào đĩa petri chứa môi trường TSA đã chuẩn bị sẵn, mỗi nồng độ pha loãng được cấy vào 3 đĩa petri đã hấp sấy vô trùng.
- Cấy xong cho vào tủ ấm, sau 24 giờ chúng ta quan sát và đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường TSA.
- Tính số lượng vi khuẩn:
Tổng số vi khuẩn(CFU/ml) = ∑
( . )
Trong đó:
C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ở hai độ pha loãng liên tiếp V: Thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa (ml)
n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được chọn để đếm số khuẩn lạc n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được chọn để đếm số khuẩn lạc d: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất
3.5.2. Phương pháp kiểm tra hình thái của vi khuẩn B. subtillis và G. thermophilus thermophilus
Sau khi cấy trên môi trường TSA/tủ ấm 37 độ/24h. Tiến hành lấy khuẩn lạc điển hình tiến hành làm tiêu bản nhuộm theo phương pháp nhuộm gram.
+ Cố định vi khuẩn B. subtilis và G. thermophilus bằng cách hơ trên ngọn lửa đền cồn.
+ Nhỏ lên tiêu bản một vài giọt thuốc nhuộm tím Gentian. Sau 1 phút rửa nước vẩy khô.
+ Nhỏ lên tiêu bản một vài giọt thuốc nhuộm lugol. Sau 1 phút, rửa nước vẩy khô.
+ Cho cồn actone chảy qua phiến kính phết vi khuẩn, rửa nước vẩy khô. + Nhỏ lên tiêu bản một vài giọt thuốc nhuộm fusin đỏ loãng, sau 1 phút rửa nước vẩy khô.
Sau khi nhuộm xong, vi khuẩn B. subtilis và G. thermophilus được tiến hành soi trên kính hiển vi. Qua kính hiển vi có thể quan sát thấy vi khuẩn
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích
thước 0,5 – 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8µm. G. thermophilus là một, Gram dương, kích thước 1.5-2.7/0.6-0.9 mm, bào tử vi khuẩn hình que, có thể phát triển hoặc đơn lẻ hoặc chuỗi, thường di chuyển được bằng roi peritrichous.