.Công thức pha môi trường Aspergillus niger- 123docz.net

Tên hóa chất Khối lượng (g)

Saccharose 4,5 𝑁𝑎𝑁𝑂3 4,5 𝐾2𝐻𝑃𝑂4 0,15 𝑀𝑔𝑆𝑂4 0,075 𝐹𝑒𝑆𝑂4 0,075 Agar 3,75 2.2.4.8 Fusarium culmorum

Công thức pha với 150ml nước cất

Bảng 2.8.Công thức pha môi trường Aspergillus niger

Tên hóa chất Khối lượng (g)

Saccharose 4,5 𝑁𝑎𝑁𝑂3 4,5 𝐾2𝐻𝑃𝑂4 0,15 𝑀𝑔𝑆𝑂4 0,075 𝐹𝑒𝑆𝑂4 0,075 Agar 3,75

Pha môi trường: Cho hỗn hợp vào 150ml nước cất, sau đó cho thêm 2,25g agar vào và khuấy đều, cho hỗn hợp vào bình Duxral, sau đó hấp ở 121ºC trong 1 giờ. Lấy hỗn hợp ra để nguội ở nhiệt độ phòng dến khi hỗn hợp khoảng 40ºC thì bắt đầu đổ vào đĩa peptri, mỗi điã peptri chứa khoảng 15ml môi trường. sau đó để môi trường nguội và bao gói bằng giấy báo rồi bỏ vào tủ lạnh 4ºC trong 24 giờ trước khi nuôi cấy.

Chuẩn bị dung dịch pha loãng: Cân 1g nguyên liệu, nghiền mịn và cho vào 9ml nước cất (ống nghiệm 1). Sau đó lấy 1ml dung dịch ống nghiệm 1 cho vào 9ml nước cất (ống nghiệm 2). Lấy 1ml ống nghiệm 2 cho vào 9ml nước cất (ống nghiệm 3).

Nuôi cấy: Hút 1ml dung dịch khuẩn ở mỗi ống cho vào đĩa peptri có môi trường, dùng que cấy dàng đều đến khi thấy mặt môi trường khô thì dừng lại. gói đĩa peptri bằng giấy rồi cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 37ºC trong 48 giờ và đếm khuẩn lạc.

2.2.5 Xác định đường tổng bằng phương pháp Bectrand.

Cân 5g mẫu vào bình tam giác cho 100ml nước đun cách thủy 80℃ trong 15 phút. Lấy ra để nguội.

Thêm 10ml Zn(CH3COOH)2 20%, lắc kỹ để kết tủa protein có trong mẫu, để lắng. Thêm 10ml dung dịch Na2HPO4 bão hòa, lắc kỹ để loại bỏ 𝑍𝑛(𝐶𝐻𝐶𝑂𝑂)2

20% dư. Định mức đến 250ml bằng nước cất. Sau đó mang đi lọc lấy dịch trong. Lấy 5ml dịch lọc cho vào bình tam giác 250ml, thêm 5ml acid HCl (1:1), đun trên bếp cách thủy 15 phút. Sau đó để nguội và cho vài giọt phenolphtalein vào bình tam giác vừa đun, thêm vài giọt NaOH 20% đến màu hồng, cho tiếp HCl (1:1) đến khi về lại màu ban đầu. Tiếp đó cho vào bình 25ml Felling A và 25ml Felling B, lắc nhẹ. Đặt trên bếp điện và đun sôi trong 3 phút, để nguội và thu kết tủa đồng (I) oxit. Mang đi chuẩn độ lượng Fe (II) hình thành trong bình tam giác bằng dung dịch KMnO4 0.1N cho đến khi dung dịch có màu hồng nhạt bền. Kết quả được tính bằng công thức:

𝐴 =𝑚𝑔 × V𝑑𝑚× 100 𝑚 × 𝑉𝑝𝑡 × 1000

Trong đó:

mg: Lượng glucose tương ứng, g với thể tích KMnO4 tiêu tốn. Vdm: Thể tích bình định mức mẫu (ml).

Vpt: Thể tích lấy mẫu (ml). m: Lượng mẫu cân (g).

2.2.6 Các hợp chất giảm đau có trong dược liệu

Xử lý mẫu: Mẫu thí nghiệm gồm trà hỗn hợp và các thành phần riêng lẽ được ngâm và chiết kiệt trong methanol nguyên chất, xử lý thông qua hệ thống siêu âm ở nhiệt độ thường, thu cao chiết của các mẫu thí nghiệm bằng phương pháp cô

quay chân không. Mẫu cao chiết được pha loãng đến nồng độ 100μg/ml và lọc qua đầu lọc PTFE 0,45μm để tiến hành chạy HPLC.

Các mẫu chuẩn được hòa tan trong methanol nguyên chất, pha loãng bằng bình định mức đến khi đạt nồng độ 50ppm, lọc qua đầu lọc PTFE 0.45μm để tiến hành đối chứng thành phần với các mẫu thí nghiệm

Mẫu chuẩn và mẫu thử nghiệm sau khi lọc sẽ được chuyển vào các vial, phân tích dựa trên hệ thống HPLC bằng cách sử dụng Mô-đun tách Waters 2695 được trang bị máy dò UV bước sóng kép Waters 2487 được đặt thành 245 nm với đầu dò DAD 1A, Ref = 360,16. Cột là một pha đảo ngược Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6 x 150 mm, 5 μm) được gắn với một cột bảo vệ Agilent Eclipse XDB-C18. Nhiệt độ cột được duy trì ở 25℃. Chương trình thực hiện với pha động gồm methanol : acetonitril : nước = 90 : 5 :5, tốc độ dòng 1ml/ phút, bước sóng 245 nm, thể tích mẫu đo: 5μl.Thời gian lưu 35 phút.

2.2.7 Phương pháp xác định hợp chất kháng viêm Ketoralac trong nguyên liệu. nguyên liệu.

Xử lý mẫu: Mẫu cao chiết dược liệu được pha loãng bằng nước cất 2 lần đến nồng độ 100μg/ml và lọc qua đầu lọc PTFE 0,45μm để tiến hành chạy HPLC.

Pha riêng dung dịch gốc chuẩn Ketoralac trong nước cất 2 lần để thu được dung dịch có nồng độ 100mg/L và lọc qua đầu lọc PTFE 0,45μm để tiến hành chạy HPLC.

Phương pháp sắc ký lỏng cao áp - HPLC: Mẫu chuẩn và mẫu thử nghiệm sau khi lọc sẽ được chuyển vào các vial, phân tích dựa trên hệ thống HPLC bằng cách sử dụng Mô-đun tách Waters 2695 được trang bị máy dò UV bước sóng kép Waters 2487 được đặt thành 245 nm với đầu dò DAD 1A, Ref = 360,16. Cột là một pha đảo ngược Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6 x 150 mm, 5 μm) được gắn với một cột bảo vệ Agilent Eclipse XDB-C18. Nhiệt độ cột được duy trì ở 25℃. Chương trình thực hiện với pha động gồm methanol : acetonitril : nước = 90 : 5 :5, tốc độ dòng 1ml/ phút, bước sóng 245 nm, thể tích mẫu đo: 5μl.Thời gian lưu 35 phút.

2.2.8 Phương pháp định lượng Estradiol trong nguyên liệu.

Xử lý mẫu: Mẫu cao chiết dược liệu được pha loãng bằng nước cất 2 lần đến nồng độ 100μg/ml và lọc qua đầu lọc PTFE 0.45μm để tiến hành chạy HPLC.

Pha riêng dung dịch gốc chuẩn Estradiol trong nước cất 2 lần để thu được dung dịch có nồng độ 100mg/L và lọc qua đầu lọc PTFE 0.45μm để tiến hành chạy HPLC.

2.2.9 Phương pháp xác định pH

Nghiền sản phẩm trong máy xay hoặc cối, lấy 1g mẫu cho vào cốc có mỏ, thêm một lượng nước gấp hai đến ba lần lượng mẫu (hoặc nhiều hơn để có độ đặc thích hợp) và đun nóng trên nồi cách thủy trong 30 min, khuấy liên tục bằng đũa thủy tinh.

Khởi động máy bằng nút “On/Off”, rửa sạch điện cực, lau khô điện cực bằng bông thấm, nhúng điện cực vào dung dịch trà, đọc giá trị pH trên màn hình, thực hiện lại nhiều lần để xem kết quả, mỗi lần đo cần nhúng qua nước cất để tăng độ chính xác.

2.3. Xử lí số liệu

Các thí nghiệm lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lí bằng phần mền SPSS 18.1 với mức ý nghĩa P < 0,05

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Độ ẩm trong nguyên liệu

Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định độ ẩm trong nguyên liệu nhằm xác định tỉ lệ % nước trong nguyên liệu có đạt tiêu chuẩn về độ ẩm và xác định được thời gian bảo quản của nguyên liệu.

.Công thức pha môi trường Aspergillus niger

Hàm lượng đường tổng trong nguyên liệu

.Phổ HPLC của mẫu trà hỗn hợp