Trần Thị Hương (2014) Nghiên cứu xác đinh hàm lượng lưu huỳnh trong một số dược liệu được được sản xuất và chế biến tại Hưng Yên. Kết quả cho thấy Các loài khác nhau thì mức độ tồn dư lưu lưu huỳnh khác nhau. Lưu huỳnh tồn dư sau khi xông lưu huỳnh dao động từ 0,027% đến 0,776% [11].
Phạm Thị Ngọc Lan (2012). Khảo sát ô nhiễm vi sinh vật trong một số thực phẩm trên địa bàn thành phố Huế. Kết quả phân tích ô nhiễm E.coli và coliforms trong mẫu trà các loại cho thấy trong 14 mẫu thì có 1 mẫu không đạt chỉ tiêu coliforms chiềm tỉ lệ là 7,1%. Trong 14 mẫu trà các loại thì có 1 mẫu không đạt chỉ tiêu E.coli chiểm tỉ lệ 7,1% [12].
1.4.2 Ngoài nước
Leong F và cộng sự. (2020) Phân tích tiêu chuẩn dược liệu Trung Quốc (Traditional Chinese medicine - TCM) cho thấy kiểm soát chất lượng TCM là rất quan trọng trong việc áp dụng TCM và sự phức tạp của TCM cho thấy khó khăn trong việc kiểm soát chất lượng và xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho TCM. Để đánh giá chất lượng TCM bằng cách quy định nguồn gốc, nhận dạng, các thông số chất lượng (như độ ẩm và tạp chất) và các thành phần hoạt chất trong TCM [32].
Yang W và cộng sự. (2017) Sử dụng phương pháp Q-markers để đánh giá tiêu chuẩn chất lượng và kiểm soát chất lượng đối với các nguyên liệu thuốc, chất chiết xuất, sản phẩm và chế phẩm. Trong nghiên cứu này, giúp kiểm soát thu hồi và truy xuất nguồn gốc của dược liệu [45].
30
Bai G và cộng sự. (2018) Việc nghiên cứu kiểm soát chất lượng, đánh giá, thiết lập tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng của TCM dựa trên phân tích hệ thống của Q-marker để nghiên cứu TCM mang lại những hiệu quả đáng kể, đảm bảo chất lượng dược liệu.
31
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1Đối tượng nghiên cứu
Ích Mẫu (Leonurus Sibiricus L), Hoa Hồng (Rosa Chinensis Jacq), Kỷ Tử
(Lycium Chinense Minor), Táo Đỏ (Ziziphus Jujuba Mill), Long Nhãn (Euphoria
Longana Steud Nephelium Longana) – được thu mua tại Công ty TNHH Núi
Thành Graden, Quảng Nam. Đây là những nguyên liệu dùng để sản xuất trà hỗ trợ giảm đau bụng kinh của nhóm nghiên cứu Hóa Y Sinh Dược - Đại học Duy Tân.
Hình 2.1.Ích Mẫu (Leonurus Sibiricus L) và Hoa Hồng (Rosa Chinensis Jacq)
32
Hình 2.5. Long Nhãn (Euphoria Longana Steud Nephelium Longana).
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Đánh giá hàm lượng lưu huỳnh của nguyên liệu
❖ Chuyển toàn bộ các dạng hợp chất lưu huỳnh trong mẫu thành SO42-
Cân 1g mẫu cho vào đáy bình phân hủy cổ dài, cho 15ml HNO3 đặc vào bình. Lắp bộ sinh hàn hồi lưu vào cổ bình, ngâm mẫu 2-3 giờ sau đó đun sôi nhẹ cho đến khi có khí màu nâu đỏ bay ra thì thêm qua ống sinh hàn một số giọt H2O2 30%. Tiếp tục đun nhẹ, nếu dung dịch trong bình cạn thì bổ sung thêm HNO3 qua ống sinh hàn, kéo dài cho tới khi dung dịch trong và không màu (6 đến 10 giờ).
Để nguội thêm nước và định mức 50ml. Cô cách thủy cho đến khô dung dịch mẫu trong bát sứ để tách Silic trước khi xác định SO42-. Hòa tan cặn khô bằng HCl 10% tiến hành 3 - 4 lần kết hợp gạt lọc thu nước lọc vào bình, rửa cặn và giấy lọc 3 - 4 lần bằng nước nóng, thu nước rửa vào bình, lên lại thể tích dung dịch mẫu để xác định SO42-.
❖ Xác định hàm lượng SO42-
Lấy vào cốc 10ml dung dịch để xác định SO42- , thêm 1ml HCl 10% và đun sôi, sau đó cho thêm 10ml dung dịch BaCl2 10% vào dung dịch đang sôi và tiếp tục đun sôi 2-3 phút tạo BaSO4 kết tủa. Lấy ra để trong tủ ấm 4 giờ ở 80oC.
33
Thử kết tủa hòa tan SO42- bằng dung dịch BaCl2, nếu còn kết tủa cho thêm 2ml BaCl2 10% tiếp tục cho đến khi kết tủa hoàn toàn. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc mịn không tro. Kết hợp gạn lọc và rửa sạch kết tủa trong cốc 2- 3 lần bằng dung dịch HCl 0.1% nóng. Dồn toàn bộ kết tủa lên giấy lọc, tráng rửa cốc 2-3 lần bằng HCl 0.1% nóng. Để ráo giấy lọc, gói kết tủa cho vào chén sứ chịu nhiệt đã xác định khối lượng.
Nung kết tủa ở 750oC cho đến khi hết màu đen. Để nguội chén trong bình hút ẩm, cân khối lượng lần thứ nhất. Tiếp tục nung thêm 30 phút, để nguội chén trong bình hút ẩm cân khối lượng lần 2. Lặp lại cho đến khi khối lượng 2 lần cân liên tiếp không thay đổi. Công thức tính hàm lượng S tổng số trong mẫu khô tuyệt đối:
%𝑆 = (𝑚2− 𝑚1− 𝑚0).0.1370.100 𝑚
Trong đó:
m (gam): Khối lượng mẫu tướng ứng với thể tích dung dịch trích m1 (gam): Khối lượng chén
m2 (gam): Khối lượng chén và kết tủa sau khi nung m0 (gam): Khối lượng mẫu trắng (tro giấy lọc) 0,137: Hệ số quy từ BaSO4
k: Hệ số quy về khô liệt
2.2.2 Xác định độ ẩm của nguyên liệu
Cân khoảng 5 g mẫu thử cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 103℃. Lấy cốc có chứa nguyên liệu đã sấy để vào bình hút ẩm, mở khóa hoặc hé mở nắp bình hút ẩm cho thông không khí với bên ngoài trong khoảng 1 phút rồi đóng kín bình hút ẩm. Để nguội bình hút ẩm 15 phút. Cân và ghi kết quả. Tiếp tục sấy trong 1giờ, để nguội và cân mẫu như trên cho đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp chênh lệch nhau không quá 1mg. Độ ẩm (W) tính theo phần trăm khối lượng xác định theo công thức:
34
𝑊 = (𝑚0− 𝑚1) 𝑚0 . 100
Trong đó:
mo (gam): khối lượng ban đầu của phần mẫu thử; m1 (gam): khối lượng của phần mẫu thử đã sấy khô
2.2.3 Xác định hàm lượng tro tổng
Nung một chén nung bằng sứ tới khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lượng của chén. Cân chính xác khoảng 1-3 gam nguyên liệu cho vào chén nung. Trải đều nguyên liệu ở đáy chén và đốt thật cẩn thận trên bếp điện cho đến khi nguyên liệu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói. Đặt chén vào lò nung ở 500 - 600℃ cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn ( tro không còn màu đen). Dùng cặp sắt lấy lò nung ra, để nguội 30 phút trong bình hút ẩm. Cân và ghi lại lượng cân. Đặt chén đựng tro vào lò nung và tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ nữa. Lấy chén ra, để nguội trong bình hút ẩm khoảng 30 phút và cân.Tiếp tục làm như vậy đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp giống nhau hoặc chênh nhau không quá 5mg. Hàm lượng tro toàn phần theo phần trăm (X1) tính bằng công thức:
𝑋1 =𝐺2− 𝐺 𝐺1− 𝐺. 100
Trong đó:
G (gam): khối lượng chén nung
𝐺1(gam): Khối lượng chén và mẫu trước khi sấy
𝐺2(gam): khối lượng chén và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi
2.2.4 Định lượng vi sinh vật trên đĩa thạch
2.2.4.1 Escherichia coli
35
Bảng 2.1.Công thức pha môi trường Escherichia coli
Tên hoá chất Khối lượng (g)
Lactose 1,5 Pepton 1,5 Oxgall 3 Brilliant 0,001995 Agar 3,75 2.2.4.2 Salmonella
Công thức pha với 150ml nước cất
Bảng 2.2.Công thức pha môi trường Salmonella
Tên hóa chất Khối lượng (g)
Lactose 1,5
Proteose pepton 1,5 Sodium citrate 3 Ferric ammonium citrate 0,3 Sodium deoxychlate 0,75 Neutral red 0,003
Agar 2,025
2.2.4.3 Bacillus cereus
Công thức pha với 150ml nước cất
Bảng 2.3.Công thức pha môi trường Bacillus cereus
Tên hóa chất Khối lượng (g)
Lactose 1,5
Proteose pepton 1,5 Sodium citrate 3 Ferric ammonium citrate 0,3 Sodium deoxychlate 0,75 Neutral red 0,003
36
2.2.4.4 Coliform
Công thức pha với 150ml nước cất
Bảng 2.4.Công thức pha môi trường Coliform
Tên hóa chất Khối lượng (g)
Lactose 1,5
Proteose pepton 1,5 Sodium citrate 3 Ferric ammonium citrate 0,3 Sodium deoxychlate 0,75 Neutral red 0,003
Agar 2,025
2.2.4.5 Aspergillus. Candidus
Công thức pha với 150ml nước cất
Bảng 2.5.Công thức pha môi trường Aspergillus. Candidus
Tên hóa chất Khối lượng (g)
Saccharose 4,5 𝑁𝑎𝑁𝑂3 4,5 𝐾2𝐻𝑃𝑂4 0,15 𝑀𝑔𝑆𝑂4 0,075 𝐹𝑒𝑆𝑂4 0,075 Agar 3,75 2.2.4.6 Alter naria
Công thức pha với 150ml nước cất
Bảng 2.6.Công thức pha môi trường Alter naria
Tên hóa chất Khối lượng (g)
Saccharose 4,5 𝑁𝑎𝑁𝑂3 4,5 𝐾2𝐻𝑃𝑂4 0,15 𝑀𝑔𝑆𝑂4 0,075 𝐹𝑒𝑆𝑂4 0,075 Agar 3,75
37
2.2.4.7 Aspergillus niger
Công thức pha với 150ml nước cất
Bảng 2.7.Công thức pha môi trường Aspergillus niger
Tên hóa chất Khối lượng (g)
Saccharose 4,5 𝑁𝑎𝑁𝑂3 4,5 𝐾2𝐻𝑃𝑂4 0,15 𝑀𝑔𝑆𝑂4 0,075 𝐹𝑒𝑆𝑂4 0,075 Agar 3,75 2.2.4.8 Fusarium culmorum
Công thức pha với 150ml nước cất
Bảng 2.8.Công thức pha môi trường Aspergillus niger
Tên hóa chất Khối lượng (g)
Saccharose 4,5 𝑁𝑎𝑁𝑂3 4,5 𝐾2𝐻𝑃𝑂4 0,15 𝑀𝑔𝑆𝑂4 0,075 𝐹𝑒𝑆𝑂4 0,075 Agar 3,75
Pha môi trường: Cho hỗn hợp vào 150ml nước cất, sau đó cho thêm 2,25g agar vào và khuấy đều, cho hỗn hợp vào bình Duxral, sau đó hấp ở 121ºC trong 1 giờ. Lấy hỗn hợp ra để nguội ở nhiệt độ phòng dến khi hỗn hợp khoảng 40ºC thì bắt đầu đổ vào đĩa peptri, mỗi điã peptri chứa khoảng 15ml môi trường. sau đó để môi trường nguội và bao gói bằng giấy báo rồi bỏ vào tủ lạnh 4ºC trong 24 giờ trước khi nuôi cấy.
Chuẩn bị dung dịch pha loãng: Cân 1g nguyên liệu, nghiền mịn và cho vào 9ml nước cất (ống nghiệm 1). Sau đó lấy 1ml dung dịch ống nghiệm 1 cho vào 9ml nước cất (ống nghiệm 2). Lấy 1ml ống nghiệm 2 cho vào 9ml nước cất (ống nghiệm 3).
38
Nuôi cấy: Hút 1ml dung dịch khuẩn ở mỗi ống cho vào đĩa peptri có môi trường, dùng que cấy dàng đều đến khi thấy mặt môi trường khô thì dừng lại. gói đĩa peptri bằng giấy rồi cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 37ºC trong 48 giờ và đếm khuẩn lạc.
2.2.5 Xác định đường tổng bằng phương pháp Bectrand.
Cân 5g mẫu vào bình tam giác cho 100ml nước đun cách thủy 80℃ trong 15 phút. Lấy ra để nguội.
Thêm 10ml Zn(CH3COOH)2 20%, lắc kỹ để kết tủa protein có trong mẫu, để lắng. Thêm 10ml dung dịch Na2HPO4 bão hòa, lắc kỹ để loại bỏ 𝑍𝑛(𝐶𝐻𝐶𝑂𝑂)2
20% dư. Định mức đến 250ml bằng nước cất. Sau đó mang đi lọc lấy dịch trong. Lấy 5ml dịch lọc cho vào bình tam giác 250ml, thêm 5ml acid HCl (1:1), đun trên bếp cách thủy 15 phút. Sau đó để nguội và cho vài giọt phenolphtalein vào bình tam giác vừa đun, thêm vài giọt NaOH 20% đến màu hồng, cho tiếp HCl (1:1) đến khi về lại màu ban đầu. Tiếp đó cho vào bình 25ml Felling A và 25ml Felling B, lắc nhẹ. Đặt trên bếp điện và đun sôi trong 3 phút, để nguội và thu kết tủa đồng (I) oxit. Mang đi chuẩn độ lượng Fe (II) hình thành trong bình tam giác bằng dung dịch KMnO4 0.1N cho đến khi dung dịch có màu hồng nhạt bền. Kết quả được tính bằng công thức:
𝐴 =𝑚𝑔 × V𝑑𝑚× 100 𝑚 × 𝑉𝑝𝑡 × 1000
Trong đó:
mg: Lượng glucose tương ứng, g với thể tích KMnO4 tiêu tốn. Vdm: Thể tích bình định mức mẫu (ml).
Vpt: Thể tích lấy mẫu (ml). m: Lượng mẫu cân (g).
2.2.6 Các hợp chất giảm đau có trong dược liệu
Xử lý mẫu: Mẫu thí nghiệm gồm trà hỗn hợp và các thành phần riêng lẽ được ngâm và chiết kiệt trong methanol nguyên chất, xử lý thông qua hệ thống siêu âm ở nhiệt độ thường, thu cao chiết của các mẫu thí nghiệm bằng phương pháp cô
39
quay chân không. Mẫu cao chiết được pha loãng đến nồng độ 100μg/ml và lọc qua đầu lọc PTFE 0,45μm để tiến hành chạy HPLC.
Các mẫu chuẩn được hòa tan trong methanol nguyên chất, pha loãng bằng bình định mức đến khi đạt nồng độ 50ppm, lọc qua đầu lọc PTFE 0.45μm để tiến hành đối chứng thành phần với các mẫu thí nghiệm
Mẫu chuẩn và mẫu thử nghiệm sau khi lọc sẽ được chuyển vào các vial, phân tích dựa trên hệ thống HPLC bằng cách sử dụng Mô-đun tách Waters 2695 được trang bị máy dò UV bước sóng kép Waters 2487 được đặt thành 245 nm với đầu dò DAD 1A, Ref = 360,16. Cột là một pha đảo ngược Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6 x 150 mm, 5 μm) được gắn với một cột bảo vệ Agilent Eclipse XDB-C18. Nhiệt độ cột được duy trì ở 25℃. Chương trình thực hiện với pha động gồm methanol : acetonitril : nước = 90 : 5 :5, tốc độ dòng 1ml/ phút, bước sóng 245 nm, thể tích mẫu đo: 5μl.Thời gian lưu 35 phút.
2.2.7 Phương pháp xác định hợp chất kháng viêm Ketoralac trong nguyên liệu. nguyên liệu.
Xử lý mẫu: Mẫu cao chiết dược liệu được pha loãng bằng nước cất 2 lần đến nồng độ 100μg/ml và lọc qua đầu lọc PTFE 0,45μm để tiến hành chạy HPLC.
Pha riêng dung dịch gốc chuẩn Ketoralac trong nước cất 2 lần để thu được dung dịch có nồng độ 100mg/L và lọc qua đầu lọc PTFE 0,45μm để tiến hành chạy HPLC.
Phương pháp sắc ký lỏng cao áp - HPLC: Mẫu chuẩn và mẫu thử nghiệm sau khi lọc sẽ được chuyển vào các vial, phân tích dựa trên hệ thống HPLC bằng cách sử dụng Mô-đun tách Waters 2695 được trang bị máy dò UV bước sóng kép Waters 2487 được đặt thành 245 nm với đầu dò DAD 1A, Ref = 360,16. Cột là một pha đảo ngược Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6 x 150 mm, 5 μm) được gắn với một cột bảo vệ Agilent Eclipse XDB-C18. Nhiệt độ cột được duy trì ở 25℃. Chương trình thực hiện với pha động gồm methanol : acetonitril : nước = 90 : 5 :5, tốc độ dòng 1ml/ phút, bước sóng 245 nm, thể tích mẫu đo: 5μl.Thời gian lưu 35 phút.
40
2.2.8 Phương pháp định lượng Estradiol trong nguyên liệu.
Xử lý mẫu: Mẫu cao chiết dược liệu được pha loãng bằng nước cất 2 lần đến nồng độ 100μg/ml và lọc qua đầu lọc PTFE 0.45μm để tiến hành chạy HPLC.
Pha riêng dung dịch gốc chuẩn Estradiol trong nước cất 2 lần để thu được dung dịch có nồng độ 100mg/L và lọc qua đầu lọc PTFE 0.45μm để tiến hành chạy HPLC.
Phương pháp sắc ký lỏng cao áp - HPLC: Mẫu chuẩn và mẫu thử nghiệm sau khi lọc sẽ được chuyển vào các vial, phân tích dựa trên hệ thống HPLC bằng cách sử dụng Mô-đun tách Waters 2695 được trang bị máy dò UV bước sóng kép Waters 2487 được đặt thành 245 nm với đầu dò DAD 1A, Ref = 360,16. Cột là một pha đảo ngược Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6 x 150 mm, 5 μm) được gắn với một cột bảo vệ Agilent Eclipse XDB-C18. Nhiệt độ cột được duy trì ở 25℃. Chương trình thực hiện với pha động gồm methanol : acetonitril : nước = 90 : 5 :5, tốc độ dòng 1ml/ phút, bước sóng 245 nm, thể tích mẫu đo: 5μl. Thời gian lưu 35 phút.
2.2.9 Phương pháp xác định pH
Nghiền sản phẩm trong máy xay hoặc cối, lấy 1g mẫu cho vào cốc có mỏ, thêm một lượng nước gấp hai đến ba lần lượng mẫu (hoặc nhiều hơn để có độ đặc thích hợp) và đun nóng trên nồi cách thủy trong 30 min, khuấy liên tục bằng đũa thủy tinh.
Khởi động máy bằng nút “On/Off”, rửa sạch điện cực, lau khô điện cực bằng bông thấm, nhúng điện cực vào dung dịch trà, đọc giá trị pH trên màn hình, thực hiện lại nhiều lần để xem kết quả, mỗi lần đo cần nhúng qua nước cất để tăng độ chính xác.
2.3. Xử lí số liệu
Các thí nghiệm lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lí bằng phần mền SPSS 18.1 với mức ý nghĩa P < 0,05
41
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 Độ ẩm trong nguyên liệu
Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định độ ẩm trong nguyên liệu nhằm xác định tỉ lệ % nước trong nguyên liệu có đạt tiêu chuẩn về độ ẩm và xác định được thời gian bảo quản của nguyên liệu.
Bảng 3.1.Kết quả độ ẩm trong nguyên liệu
Mẫu Độ ẩm (%) Dược điển IV (%)
Ích mẫu 12,45 ≤13,5 Kỷ tử 12,40 ≤13,0 Long nhãn 14,90 ≤15,0 Hoa hồng 9,20 ≤13,0 Táo đỏ 10,60 ≤13,0 Trà hổn hợp 8,95 ≤10,0
Qua Bảng 3.1 cho thấy, độ ẩm của các nguyên liệu sử dụng để sản xuất trà nằm trong khoảng 9,2% - 14,9%. Độ ẩm của ích mẫu, kỷ tử, long nhãn, hoa hồng và táo đỏ lần lượt là: 12,45%; 12,40%; 14,90%; 9,20% và 10,60%. Độ ẩm của hoa hồng là thấp nhất đạt 9,2% và độ ẩm của long nhãn cao nhất đạt 14,9%. Long nhãn có độ ẩm cao vì trong long nhãn có hàm lượng mật ngọt khá cao 26,91%, nếu tiếp xúc với không khí sẽ dễ ẩm, xuống màu. Chính vì vậy, nên long nhãn có độ ẩm cao nhất trong 5 nguyên liệu, nhưng vẫn nằm trong khoảng cho phép. Và độ ẩm