b. Bảo quản khô
2.3Thẩm định phương pháp phân tích
2.3.1 Tầm quan trọng của việc thẩm định
Thẩm định phương pháp phân tích là một quá trình tiến hành thiết lập bằng thực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minh rằng phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến. Nói cách khác, việc thẩm định một phương pháp phân tích yêu cầu chúng ta phải chứng minh một cách khoa học rằng khi tiến hành thử nghiệm các sai số mắc phải là rất nhỏ và chấp nhận được.
2.3.2 Nội dung thẩm định
Cơ sở để thẩm định một quy trình phân tích dựa vào các cơ sở sau [25] : Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn
Độ đúng (accuracy) Độ lặp lại
Giới hạn phát hiện (limit of detection) Giới hạn định lượng (limit of quantitation).
2.3.2.1 Độ tuyến tính (Linearity)
Độ tuyến tính diễn tả sự tương quan giữa nồng độ chất khảo sát trong các dung dịch đo của mẫu thử với kết quả phân tích của phương pháp. Sự tương quan tuân theo phương trình bậc 1: y = f(C) = ax + b.
Độ tuyến tính thể hiện qua hệ số tương quan tuyến tính (R).
R càng gần bằng 1 thì phương pháp thử có độ tuyến tính càng cao.
Cách xác định:
Tiến hành thực nghiệm để xác định ứng với các nồng độ x biết trước các giá trị đo được y. Như ta đã biết nếu y phụ thuộc tuyến tính vào x có nghĩa là trong khoảng nồng độ cần khảo sát đường biểu diễn của y theo x theo một đường thẳng (đoạn thẳng) theo phương trình sau: y = ax + b.
Dựa vào kết quả thu được từ thực nghiệm của x và y tương ứng ta tính hệ số tương quan: 1 1 2 2 2 2 1 (Xi ).(y ) x y nXY R nX nY
Bùi Thị Ngọc Hân 28 2102244 X, Y là các giá trị trung bình
R phải nằm trong giá trị -1,+1.
Nếu R = 1: có tương quan tuyến tính rõ rệt. R > 0: có tương quan đồng biến.
R < 0: có tương quan nghịch biến.
R < 0,5: coi như không có tương quan tuyến tính. R > 0,5: có phụ thuộc tuyến tính.
Sau khi đã xác định được khoảng tuyến tính của phương pháp, ta có thể xây dựng được phương trình hồi quy của khoảng này tức là đi tìm được hệ số a và b của phương trình trên:
2 2 (Xi i) i i i i X Y Y n a X X n b = y – ax
Như vậy sau khi đã xây dựng được phương trình đường chuẩn, khi biết được x thì suy ra y.
Yêu cầu: Tùy theo hoạch định mà chọn giá trị R. Nói chung R > 0,999
2.3.2.2 Độ đúng (Accuracy)
Độ đúng là độ sát gần của giá trị tìm thấy với gái trị thực khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng một mẫu thử đã được làm đồng nhất trong cùng điều kiện xác định.
Đại lượng đặc trưng cho độ đúng: BIAS, tỉ lệ phục hồi.
BIAS: là hiệu giữa hàm lượng thêm vào và hàm lượng tìm lại được bằng qui trình.
Độ đúng biểu thị bằng tỉ lệ phần trăm (%) phục hồi của giá trị thêm vào mẫu thử bằng phương pháp xây dựng.
Cách thực hiện:
Xác định hàm lượng của chất cần thử trong mẫu đem thử bằng phương pháp dự kiến.
Cho vào mẫu thử một lượng chất chuẩn của chất cần thử có hàm lượng bằng 80%, 100%, 120% so với hàm lượng chất đó có trong mẫu thử, rồi tiến hành bằng phương pháp đề xuất.
Cách tính độ đúng
Hàm lượng tìm lại:
Hàm lượng chuẩn thêm vào là: x
Tỉ lệ phục hồi (Đ) = 100%
x
Yêu cầu: 98% ĐTB 102%
2.3.2.3 Độ lặp lại
Độ lặp lại (hay độ chính xác) là mức độ gần sát giữa các kết quả thử riêng lẻ với giá trị trung bình x thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng điều kiện xác định.
Độ lặp lại bị ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên.
Độ lặp lại thường được thể hiện bằng độ lệch chuẩn (SD) hay độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của một loạt các lần thử nghiệm.
Cách thực hiện
Với cùng một mẫu được làm đồng nhất, tiến hành xác định bằng phương pháp đề xuất n lần (n = 6–10 hay nhiều hơn). Sau đó áp dụng công thức tính SD và RSD của phương pháp.
Yêu cầu: RSD càng nhỏ, phương pháp phân tích càng chính xác, RSD do mỗi phòng thí nghiệm đưa ra. Thông thường ta chọn RSD 2%.
2 1 (x ) 1 n i i X SD n X: Giá trị trung bình 100% SD RSD X i x X n
2.3.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) (Limit of detection)
Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất thử trong một mẫu thử còn có thể phát hiện bằng phương pháp đề xuất, nó là một thông số của phương pháp thử giới hạn.
Giới hạn phát hiện thường được biểu thị bằng nồng độ phần trăm, phần ngàn, phần tỷ của chất thử có trong mẫu. Việc xác định giới hạn phát hiện không cần thiết phải tiến hành định lượng chính xác mà chỉ cần xác định chất thử có nồng độ thấp hơn hay cao hơn một giới hạn nào đó.
Bùi Thị Ngọc Hân 30 2102244
Cách xác định:
Giới hạn phát hiện được xác định dựa vào phương trình hồi qui tuyến tính của mẫu thử và các thông số thống kê (trắc nghiệm F–phân phối Fischer và trắc nghiệm t–phân phối Student).
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection = LOD) được tính theo công thức:
2.3.2.5 Giới hạn định lượng (LOQ) (Limit of quantification)
Giới hạn định lượng là một thông số của phương pháp phân tích định lượng các hợp chất có trong một khung mẫu với lượng thấp nhất như những tạp chất trong nguyên liệu làm thuốc và sản phẩm phân hủy có trong chế phẩm.
Giới hạn định lượng là nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong một mẫu thí nghiệm còn có thể xác định được với độ đúng và độ chính xác có thể chấp nhận được.
Giới hạn định lượng có thể được biểu thị bằng nồng độ phần trăm, phần ngàn, phần tỷ có chất cần phân tích có trong mẫu.
Xác định: Giới hạn định lượng được xác định dựa vào phương trình hồi qui tuyến tính của mẫu thử và các thông số thống kê (trắc nghiệm F–phân phối Fischer và trắc nghiệm t–phân phối Student).
Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation = LOQ) được tính theo công thức:
LOD = 3,3 * SD/độ dốc
Chương 3 THỰC NGHIỆM