b. Bảo quản khô
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm và thời gian tiến hành
Đề tài thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 9–2013 đến tháng 12– 2013. Tại phòng thí nghiệm Hóa đại cương A3, Khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị
Micropipet loại 100 và 1000 L Pipet 5 mL và 10 mL
Dụng cụ thủy tinh: erlen 250 mL, becher 100 mL, bình định mức,….
Máy UV – Vis 6800 Cân điện tử
Dụng cụ thủy tinh Bể siêu âm
Bùi Thị Ngọc Hân 32 2102244
3.1.3 Hóa chất
Perchloric acid (HClO4) đậm đặc 70–72% Acetic acid băng (CH3COOH) (Trung Quốc) Methanol (Trung Quốc)
Ethanol 96% (Trung Quốc) Nước cất
Vanillin (Pháp): Pha hỗn hợp vanillin–acetic acid băng 5%. Cân chính xác 2,5 g vanillin dạng bột (màu trắng), thêm vào một lượng nhỏ acetic acid băng, khuấy đều cho đến khi vanillin tan hoàn toàn. Chuyển sang bình định mức 50 mL, định mức tới vạch bằng acetic acid băng. Dung dịch tiếp tục được lắc cho đến khi phân bố tốt. Hỗn hợp được bảo quản ở điều kiện thoáng mát, trong bóng tối.
Chuẩn Oleanolic acid 10 mg (Merk): Pha dung dịch chuẩn có nồng độ gốc 100 ppm. Từ ống chuẩn 10 mg chuyển qua bình định mức 100 mL, cẩn thận tráng ống chuẩn nhiều lần với methanl, định mức tới vạch bằng methanol. Bảo quản ở nhiệt độ từ 2–8°C, tránh ánh sáng. Lưu ý methanol dễ bay hơi, qua thời gian methanol bay hơi sẽ làm cho nồng độ của chất chuẩn tăng lên gây sai số, cần phải bịt kín khi bảo quản.
3.1.4Thu mẫu
Sau đây là 10 mẫu nấm Linh chi được cung cấp bởi Công ty Dược Hậu Giang và một số mẫu mua trên địa bàn Thành phố Cần Thơ.
Ngày nhận mẫu: 08/08/2013
Địa điểm nhận mẫu: Công ty Cổ phần Dược Hậu Giang. Địa chỉ: 288 Bis, Nguyễn Văn Cừ, Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ.
Mẫu đem về được chứa trong túi nilon, sau đó cắt nhỏ mẫu sao cho kích thước gần bằng nhau với đường kính khoảng 1 mm. Khi cắt nhỏ từng mẫu xong, trộn đều mẫu, chia mẫu làm thành 4 phần bằng nhau một cách ngẫu nhiên theo hình chữ thập, sau đó lấy hai phần mẫu đối diện nhau, trộn lại, tiếp tục chia thành 4 phần bằng nhau, lấy hai phần đối diện trộn lại, tiếp tục làm như thế cho đến khi lấy được một lượng mẫu đủ để đem đi phân tích. Mẫu được bảo nơi khô thoáng, tránh ẩm mốc.
Trước khi đem đi phân tích mẫu được xay nhuyễn thành bột để dễ dàng chiết hoạt chất. Cần lưu ý bột mẫu dễ dàng hút ẩm trở lại nên cần bảo quản cẩn thận bằng túi nilon hai lớp.
Trong 10 mẫu được cung cấp bởi Công ty Cổ phần Dược Hậu Giang có 2 mẫu đã được định danh và 8 mẫu còn lại được Công ty mua trôi nổi trên thị trường thành phố Cần Thơ:
Mẫu 6: Ganoderma lucidum VINA (VINA: Việt Nam) Mẫu 10: Ganoderma lucidum TG (TG: Tiền Giang)
3.1.5 Qui trình chiết mẫu
Qui trình cụ thể: Cân chính xác 1 g bột mẫu (đã được sấy khô đến khối lượng không đổi) cho vào cốc đã chứa sẵn 30 mL ethanol 96%. Đặt cốc vào bình chiết siêu âm, chiết trong vòng 30 phút, lặp lại quá trình chiết nhiều lần cho đến khi chiết kiệt mẫu (đến khi dịch chiết cuối không còn màu). Cho bay hơi dung môi trong bể điều nhiệt ở 60–65°C đến cắn. Dùng pipet hút chính xác 10 mL methanol để hòa tan cắn trở lại, sau đó cho vào bình định mức 50 mL và định mức tới vạch bằng methanol. Bảo quản trong tủ lạnh, để sau này định lượng.
Sơ đồ tổng quát của qui trình chiết triterpenoid tổng bằng phương pháp chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm:
Bùi Thị Ngọc Hân 34 2102244
Hình 3.3. Qui trình chiết triterpenoid tổng bằng sóng siêu âm
3.1.6 Qui trình chuẩn bị mẫu phân tích
Hút một lượng chính xác 250 L dịch chiết mẫu chuyển sang bình định mức 10 mL, cho bay hơi hết methanol trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ từ 60– 70°C. Sau đó thêm tiếp 0,3 mL thuốc thử hiện màu vanillin–acetic acid băng 5% và 1 mL HClO4 . Đem ủ trong bể điều nhiệt ở 70°C trong 25 phút, sau đó làm lạnh trong chậu nước đá khoảng 2 phút. Cuối cùng định mức tới vạch bằng acetic acid băng, đem đi đo ở bước sóng đã khảo sát.
Sơ đồ tổng quát:
Hình 3.4. Qui trình định lượng triterpenoid tổng trong nấm Linh chi Mẫu chuẩn và mẫu trắng chuẩn bị tương tự như hình 3.4 nhưng không có Mẫu chuẩn và mẫu trắng chuẩn bị tương tự như hình 3.4 nhưng không có mẫu thử thay vào đó là chất chuẩn (đối với mẫu chuẩn).
3.1.7 Hoạch định thí nghiệm
Thẩm định các phương pháp phân tích. Tiến hành các thí nghiệm sau: Thí nghiệm về xác định khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn Thí nghiệm về xác định độ đúng
Thí nghiệm về xác định độ lặp lại
Thí nghiệm về xác định giới hạn phát hiện Thí nghiệm về xác định giới hạn định lượng
Áp dụng phương pháp đã đề ra đưa vào phân tích triterpenoid tổng trong 10 mẫu nấm Linh chi ở phòng thí nghiệm.