b. Bảo quản khô
1.3 Các nghiên cứu về định lượng triterpenoid tổng
Triterpenoid là một nhóm chất rất đa dạng, chúng được phân bố rộng rãi trong nhiều loài động, thực vật khác nhau. Chúng có nhiều tác dụng dược học đáng quý mà khoa học đã chứng minh được, vì thế đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu định lượng cũng như nhận biết các hoạt chất thuộc nhóm triterpenoid trên thế giới đã được thực hiện bằng nhiều phương pháp bởi nhiều nhà khoa học khác nhau.
Trong đó, để xác định hàm lượng triterpenoid tổng thì phương pháp được sử dụng phổ biến nhất đó là phương pháp so màu, trong nhiều công trình của nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng phương pháp này thì có một số điểm khác biệt giữa các qui trình như là: khác nhau về bước sóng hấp thụ, khác nhau về chất chuẩn, chất hiện màu, thời gian cũng như là dung môi chiết mẫu.
1. Theo Xiang và các cộng sự (2001) đã sử dụng phương pháp so màu để định lượng triterpenoid tổng số trong lá Ceriops Decandra với chất chuẩn là Oleanolic acid (nồng độ gốc là 604 g/L). Đường chuẩn được xây dựng với các ống nghiệm 10 mL chứa lần lượt 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 và 0,6 mL dung dịch chuẩn gốc, thêm vào 0,2 mL hỗn hợp 5% vanillin–acetic acid (w/v) và 1,2 mL acid perchloric, ủ trong bể điều nhiệt ở 70°C trong khoảng 15 phút, sau đó làm lạnh trong chậu nước đá khoảng 2 phút. Cuối cùng thêm ethyl acetate vào để tổng thể tích đạt được 5 mL, để nguội ở nhiệt độ phòng. Mẫu trắng được chuẩn bị là dung dịch acetic acid. Độ hấp thụ được quét trên máy UV–Vis trong vùng bước sóng 200–700 nm. Độ hấp thụ A của chất chuẩn sẽ được xác định ở bước sóng 550 nm trong curve dày 1 cm. Hàm lượng triterpenoid tổng sẽ được xác định dựa vào đường chuẩn. Cũng theo Xiang và các cộng sự đã khảo sát thì khoảng thời gian cho phản ứng lên màu tốt là 15–25 phút [16]
. Trong nghiên cứu có bước khảo sát thời gian cho phản ứng lên màu tối ưu và khảo sát vùng bước sóng hấp thụ cực đại giúp cho việc xác định chính xác hàm lượng chất cần phân tích. Tuy nhiên, trong phương pháp cuối cùng lại thêm vào ethyl acetate thay vì thêm vào dung dịch đệm acetic acid, cũng không có bước cho bay hơi hết dung môi trong dung dịch chuẩn gốc và trong dịch chiết mẫu điều này có thể làm ảnh hưởng đến nền mẫu trong quá trình định lượng (vì đường nền có thể bị nhiễu bởi các dung môi).
2. Theo X. Bai và các cộng sự (2007), định lượng triterpenoid tổng trong thân của cây Actinidia deliciosa dựa trên phản ứng màu với vanillin và ursolic acid là chất chuẩn. Lấy một lượng dịch chiết, thêm vào đó 0,3 mL hỗn hợp 5% vanillin–acetice acid và 1 mL acid perchloric, cho phản ứng trong vòng 15 phút ở 60°C, sau đó làm lạnh trong chậu nước đá. Độ hấp thụ của mẫu sẽ đo ở
Bùi Thị Ngọc Hân 22 2102244 bước sóng 520 nm. Hàm lượng triterpenoid tổng sẽ được xác định dựa theo
đương chuẩn của ursolic acid đã xây dựng (Cursolic acid (g)).
Với các điều kiện được sử dụng trong nghiên cứu này thì: đường chuẩn được xây dựng trong khoảng 0–16,5 g, độ lệch chuẩn bé hơn 4%, hiệu suất thu hồi (độ đúng) đạt từ 93–115%, hệ số tương quan R2
= 0,9937 [17].
Đường chuẩn của ursolic acid trong phương pháp được xây dựng bằng cách cân khối lượng (Cursolic acid (g)) dễ gây sai số, không chính xác, không cho bay hơi dung môi trong dịch chiết làm ảnh hưởng tới tín hiệu đường nền.
3. Theo Jie–Ping Fan và Chao–Hong He (2006), trong “Simultaneous quantification of three major bioactive triterpene acids in the leaves of
Diospyros kaki by high-performance liquid chromatography method” cũng đã sử dụng phương pháp so màu để xác định hàm lượng triterpenoid tổng. Lấy một lượng dịch chiết phù hợp thu được sau khi chiết mẫu hòa tan trong 25 mL ethanol, lấy 0,2 mL dịch chiết sau đó làm bay hơi hết dung môi trong bể điều nhiệt, thêm vào 0,3 mL hỗn hợp 5% vanillin–acetic acid và 1 mL acid perchloric, mẫu được gia nhiệt trong vòng 45 phút ở 60°C sau đó làm lạnh trong chậu nước đá. Độ hấp thụ của mẫu được đo ở 548 nm sau khi thêm vào 5 mL acetic acid băng. Ursolic acid được sử dụng làm chất chuẩn.
Sau khi tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm được sử dụng trong qui trình: đường chuẩn được xây dựng nằm trong khoảng 0–0,0126 mg/mL. Phương trình hồi qui được tính toán như sau: y = 0,0167x – 0,0015 (trong đó y là nồng độ của ursolic acid (mg/mL) và x là độ hấp thụ của mẫu) với hệ số tương quan R2=0,9995. Độ lệch nhỏ hơn 4%. Hiệu suất thu hồi của triterpenoid tổng được thực hiện bằng cách thêm vào một lượng chất chuẩn đạt 94–112% [18].
Thời gian cho phản ứng lên màu là quá dài 45 phút thay vì 15–25 phút như đã khảo sát bởi Xiang et. al (2001) điều này làm cho cường độ màu của dung dịch có thể không tối ưu, khoảng xây dựng đường chuẩn nhỏ 0–0,0126 mg/mL. Ưu điểm của phương pháp là đã cho bay hơi hết dung môi không gây ảnh hưởng đến tín hiệu nền.
4. Theo Jiewen Zhao (4–2011) đã mô tả qui trình định lượng triterpenoid tổng bằng phương pháp UV–Vis với vanillin–perchloric acid làm chất hiện màu trong “The extraction of high value chemicals from heather (Calluna vulgaris) and bracken (Pteridium aquilinum)” cụ thể: 10 mg Oleanolic acid được hòa tan trong 50 mL methanol, sau đó chuẩn bị một dãy chuẩn làm việc với tám ống nghiệm lần lượt chứa 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, va 0,7 mL
dung dịch chuẩn và cho bay hơi hết dung môi trong bể điều nhiệt. Thêm vào ống nghiệm 0,3 mL hỗn hợp 5% vanillin–acetic acid và 1 mL acid perchloric, đem ủ trong bể điều nhiệt ở 70°C trong vòng 25 phút. Sau đó làm lạnh trong chậu nước đá và thêm vào 10 mL acetic acid băng. Độ hấp thụ của dung dịch được đo ở bước sóng 550 nm và tạo ra đường chuẩn.
Tiến hành đo trên mẫu: 10 mg của dịch chiết CO2 siêu tới hạn (hoặc dịch chiết hexan) hòa tan trong 1 mL dichloromethane trong ống nghiệm. Cho dung môi bay hơi trong bể điều nhiệt. Tương tự cũng cho 0,3 mL hỗn hợp 5% vanillin–acetic acid và 1 mL acid perchloric trước khi đem ủ ở 70°C trong 25 phút. Dung dịch được làm lạnh trong bể nước đá và sau đó thêm vào ống nghiệm 10 mL acetic acid băng. Độ hấp thụ của dịch chiết cũng được đo ở 550 nm và hàm lượng triterpenoid tổng trong mẫu được xác định dựa theo đường chuẩn Oleanolic acid đã xây dựng [19]
.
Quá trình chiết mẫu của phương pháp là chiết với CO2 siêu tới hạn điều này không thể áp dụng trong làm việc ở phòng thí nghiệm, do đó kết quả thực nghiệm của đề tài làm ra không thể so sánh được. Phương pháp trong nghiên cứu này đã được cải tiến nhiều so với các nghiên cứu trước.
5. Trong “In vitro inhibitory effects of Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth. seeds on intestinal α-glucosidase and pancreatic α-amylase” của Dnyaneshwar Madhukar Nagmoti, Archana Ramesh Juvekar (28–4–2013) cũng đã xác định được hàm lượng triterpenoid tổng bằng cách: 250 L dịch chiết được trộn với 0,25 mL hỗn hợp 5% vanillin–acetic acid và 0,5 mL acid perchloric. Hỗn hợp được ủ trong trong 10 phút, làm lạnh trong bể nước đá 15 phút và sau đó thêm vào 2,5 mL acetic acid băng. Sau 6 phút, độ hấp thụ được đọc ở 538 nm. Oleanolic acid làm chất chuẩn và hàm lượng triterpenoid tổng được xác định thông qua đường chuẩn của Oleanolic acid (OAE, mg/g dịch chiết) [20].
Thời gian cho phản ứng lên màu là không tối ưu, trong khi đó thời gian làm lạnh lại dài hơn.
Theo mục tiêu của đề tài thì phương pháp được sử dụng để định lượng triterpenoid tổng phải là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, với độ chính xác cao và phù hợp với từng cơ sở thí nghiệm. Trong điều kiện trang thiết bị hiện có của phòng thí nghiệm có thể định lượng triterpenoid tổng bằng 2 phương pháp: phương pháp HPLC và phương pháp UV–Vis. Trong đó, phương pháp HPLC là phương pháp thực hiện với độ chính xác cao, độ nhạy tốt, có thể phân tích nhiều hợp chất, tuy nhiên, phương pháp này lại ít chọn lọc nên khó loại bỏ hết ảnh hưởng của nền mẫu, phải lựa chọn dung môi và phải khảo sát
Bùi Thị Ngọc Hân 24 2102244 các thông số chạy máy. Đối với phương pháp UV–Vis là một phương pháp
được sử dụng phổ biến, dễ thực hiện và mang lại hiệu quả cao.
Ưu điểm: dễ làm, đơn giản, độ chính xác cao, có thể phân tích được nhiều mẫu cùng một lúc.
Chương 2 GIỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TRITERPENOID TỔNG