1.4.3. Pha tĩnh 1.4.3.1.Khái niệm
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách 1 hỗn hợp chất phân tích. Nó là những chất rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ hạt từ 3-10µm, diện tích bề mặt thường từ 50-500m2/g.[5]
1.4.3.2. Phân loại
- Dựa vào bản chất của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay rây phân tử. Tương
ứng với loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc kí riêng trong kĩ thuật HPLC.
- Dựa vào trạng thái rắn hay lỏng của pha tĩnh, người ta chia nó thành hai loại, nếu pha tĩnh là chất rắn ta có sắc ký lỏng rắn (LSC), nếu pha tĩnh là lỏng ta có sắc ký lỏng lỏng (LLC).
- Dựa vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động, có các loại: sắc ký pha thuận (pha tĩnh phân cực còn pha động ít phân cực), sắc ký pha đảo (pha tĩnh ít phân cực còn pha động thì phân cực), sắc ký pha đảo tạo cặp ion và sắc ký trao đổi ion.
- Dựa vào cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, người ta chia nó thành 2 loại là xốp toàn phần hạt và xốp bề mặt hạt (xốp chỉ lớp vỏ ngoài).
1.4.3.3.Điều kiện đối với một pha tĩnh
-Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc kí.
-Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký nhất định.
-Tính chất bề mặt phải ổn định (đặc biệt là đặc trưng xốp của nó). -Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt. -Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất. [5]
1.4.4. Pha động 1.4.4.1.Khái niệm
Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất tan (chất cần phân tích) ra khỏi cột tách để thực hiện quá trình sắc ký. Đây là một yếu tố rất linh động và dễ dàng thay đổi. Nó có thể là một dung môi hoặc hỗn hợp nhiều dung môi trộn lẫn với nhau theo những tỉ lệ nhất định. Nó có thể là dung dịch hoặc các muối có chứa các chất đệm, chất tạo phức... Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi rửa giải riêng để có được hiệu quả phân tách tốt nhất.[5]
- Rửa giải gradient: pha động liên tục thay đổi (do tỉ lệ tạo nên các thành phần pha động thay đổi) trong suốt quá trình rửa giải. Lúc này độ phân cực của pha động cũng sẽ bị biến đổi và thường là tăng hiệu quả tách .[5]
1.4.4.3. Điều kiện đối với một pha động
- Phải trơ đối với pha tĩnh.
- Hòa tan được chất cần phân tích. - Bền vững theo thời gian.
- Có độ tinh khiết cao.
- Phải nhanh đạt các cân bằng trong sắc ký.
- Phù hợp với các loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích. - Có tính kinh tế và không khan hiếm.
Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu. Nó quyết định thời gian lưu giữ các chất mẫu và hiệu quả sự tách sắc ký.
Pha động có thể ảnh hưởng đến: - Độ chọn lọc của hệ pha.
- Thời gian lưu giữ của chất tan. - Hiệu lực của cột tách.
- Độ phân giải các chất trong một pha tĩnh. - Độ rộng và sự cân đối của peak sắc ký.
Tất cả các dung môi dùng trong HPLC (kể cả pha động) đều được đuổi khí bằng cách đun nóng, hút chân không, lắc siêu âm... Vì không khí hòa tan trong dung môi sẽ tạo bọt khí trong detector và gây nhiễu tín hiệu. [5]
1.4.5. Đánh giá peak
1.4.5.1.Đánh giá diện tích peak
Diện tích peak của một chất tương ứng với tổng lượng chất đó. Để tính diện tích peak, hiện nay người ta dùng máy phân tích điện tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5%) hoặc máy phân tích cơ học (sai số khoảng 1,3%). Phương pháp này
có thể dùng cho các peak không bị trôi đường nền và cả peak có đường nền bị trôi. Phương pháp này chỉ cần điểm đầu và điểm cuối của peak được nhận ra chính xác và cho kết quả tốt đối với nồng độ trung bình, vừa và cao. [1]
1.4.5.2.Đánh giá chiều cao peak
Khi peak có dạng không đổi thì chiều cao peak (khoảng cách giữa đường nền và đỉnh peak) là một đại lượng tỉ lệ với diện tích peak và nó cũng có thể dùng để đánh giá sắc ký đồ. Phương pháp này chỉ áp dụng khi các chỉ số là hằng định. Với các peak có đường nền bị nhiễu hoặc peak hẹp thì việc xác định chiều cao peak sẽ dễ dàng chính xác hơn việc đánh giá diện tích peak. [1]
1.4.6. Đánh giá kết quả
1.4.6.1.Phương pháp ngoại chuẩn
Phương pháp dựa trên cơ sở so sánh mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng điều kiện. Kết quả của chất chưa biết được tính toán so với mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ hoặc suy ra từ đường chuẩn.[1]
1.4.6.2.Phương pháp nội chuẩn
Phương pháp nội chuẩn là phương pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng chất không đổi, mà trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử. Nó được tách hoàn toàn và có nồng độ gần bằng nồng độ của chất cần phân tích và có cấu trúc hóa học tương tự. [1]
1.4.6.3.Phương pháp thêm chuẩn
Chủ yếu được sử dụng trong kĩ thuật HPLC khi có vấn đề ảnh hưởng của các chất phụ (ví dụ: tá dược). Dung dịch mẫu thử được thêm một lượng xác định chất chuẩn. Các peak thu được của cả 2 dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chất chuẩn phải được đo trong cùng điều kiện sắc ký. Kết quả được tính toán dựa vào sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng
1.4.6.4.Phương pháp tính theo phần trăm diện tích peak
Nồng độ của mẫu thử được tính toán dựa trên diện tích pic tính theo tỉ lệ phần trăm diện tích pic chất thử trên tổng số diện tích toàn bộ pic có trong sắc ký đồ. Trong HPLC, phương pháp này chỉ đúng khi có sự đáp ứng của detector trên các chất như nhau, nếu không như nhau khi đó mỗi chất cần có hệ số hiệu chỉnh [1].
Chương 2: THỰC NGHIỆM
2.1.Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là lá chanh Thái tươi và khô, quả chanh Thái tươi được thu hái vào tháng 6 năm 2019 tại thành phố Pakse tỉnh Champasack, Lào.