Phương pháp chiết và phân lập hợp chất hữu cơ

2. Mục tiêu của đề tài

2.3. Phương pháp chiết và phân lập hợp chất hữu cơ

2.3.1. Sơ đồ chiết và phân lập hợp chất hữu cơ

Hình 2.2. Sơ đồ quy trình chiết và phân lập hợp chất từ lá chanh Thái

Bột lá chanh Thái (2,5 kg)

- Ngâm bằng ethanol (3 lần)

- Lọc, cô quay, thu hồi dung môi.

Cao ethanol

- Ngâm chiết bằng n-hexan. - Lọc, cô quay, thu hồi dung môi.

Cao chiết n-hexan Dịch chiết nước

- Ngâm chiết bằng ethyl acetate . - Lọc, cô quay, thu hồi dung môi.

Dịch chiết nước Cao chiết ethyl acetate

Sắc ký cột

2.3.2. Phương pháp chiết hợp chất hữu cơ

Mẫu lá chanh Thái tươi được thu hái, rửa sạch, phơi héo, sau đó sấy ở nhiệt độ 1000C trong vòng 5-7 phút để diệt men, sau đó sấy khô ở 500C cho đến khi khô kiệt, nghiền nhỏ thành bột.

Để chiết các hợp chất ra khỏi nguyên liệu, chúng tôi sử dụng kỹ thuật chiết rắn - lỏng theo phương pháp ngấm dần.

Thực nghiệm: Lấy 2,5 kg bột lá chanh Thái đem ngâm chiết với 5-7 lít ethanol (70%), quá trình chiết được lặp lại 3 lần ở nhiệt độ phòng, thời gian cho mỗi lần chiết 48 giờ đủ để cho dung môi thẩm thấu vào toàn bộ phần chất của bột lá chanh Thái, gia tăng hiệu quả chiết bằng cách thỉnh thoảng khuấy, trộn đều hỗn hợp. Sau đó hỗ hợp chiết được lọc qua tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có được dịch chiết etanol, loại bỏ phần bã lá chanh Thái. Gom các dịch chiết và cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao thô ethanol (210 g).

Cao thô ethanol được phân bố vào nước cất vừa đủ và tiến hành chiết lần lượt với n-hexan, ethyl acetate, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao tương ứng n-hexan (30 gam), ethyl acetat (55 g). Phân lập cao ở các phân đoạn bằng phương pháp sắc kí cột trên silica gel với các hệ dung môi thích hợp.

2.3.3. Quá trình phân lập các chất từ cao ethyl acetate

Từ 55 gam cao ethyl acetate đem hòa tan trong một lượng tối thiểu dung môi ethyl acetate, sau đó cho cao chiết trộn với silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 μm), sấy khô và nghiền nhỏ cho đến khi tạo thành hỗn hợp bột mịn.

Nhồi silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 μm) vào cột sắc kí kích thước cột 60 cm x 6 cm (chiều dài x đường kính cột), ổn định cột bằng dung môi n-hexan. Hệ dung môi tiến hành rửa giải là n-hexan: ethyl acetate với độ phân cực của dung

Bảng 2.1.Kết quả sắc ký cột silica gel của cao chiết Ethyl acetate

Phân đoạn Dung môi giải ly V(ml) dung môi

1 n-hexan : ethyl acetate = 9 :1 200

2 n-hexan : ethyl acetate = 8,5 : 1,5 200 3 n-hexan : ethyl acetate = 6 : 1 140 4 n-hexan : ethyl acetate = 5 : 1 180 5 n-hexan : ethyl acetate = 4 : 2 180 6 n-hexan : ethyl acetate = 3 : 3 120 7 n-hexan : ethyl acetate = 2 : 4 180

8 ethyl acetate 150

Sau đó các chất có Rf giống nhau trên sắc ký lớp mỏng được gom vào cùng một phân đoạn thu được 6 phân đoạn ET1- ET6

Phân đoạn ET4 (6,0 g) được sắc kí trên cột silica gel, kích thước cột 50 cm x 3 cm; hệ dung môi giải ly n - hexan: methanol như sau

Bảng 2.2. Kết quả sắc ký cột silica gel của phân đoạn ET4

STT Dung môi giải ly V(ml) dung môi

1 n-hexane : methanol = 95:5 200

2 n-hexane : methanol = 85:15 100

3 n-hexane : methanol = 75:25 300

4 n-hexane : methanol = 65:35 100

5 n-hexane : methanol = 55:45 200

Chấm sắc kí lớp mỏng để gom các phân đoạn có Rf giống nhau, kết quả thu được 4 phân đoạn ET4.1 - ET4.4.

Phân đoạn ET4.2 được tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi rửa giải ethyl aceate thu được 1 hợp chất màu vàng có Rf = 0,45 (CHCl3-MeOH 85:15), kí hiệu KS1 (45 mg).

Từ phân đoạn ET4.3 được tinh chế bằng cách kết tinh lại trong methanol thu được 1 hợp chất màu vàng kí hiệu KS2 (30 mg).

2.4. Phương pháp khảo sát cấu trúc hóa học các chất

Cấu trúc hợp chất tinh khiết được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), carbon- 13 (13C-NMR), HSQC, HMBC và so sánh với các tài liệu tham khảo.

2.5. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC)

2.5.1. Chuẩn bị các dung dịch phân tích xác định đường chuẩn Vitamin C

Dung dịch chuẩn gốc: Cân 0,1g chất vitamin C (merck) cho vào bình định mức 10ml. Thêm 5ml nước cất 2 lần sau đó lắc đều, rung siêu âm 10 phút cho chất hòa tan hoàn toàn. Sau đó định mức đúng vạch thu được dung dịch vitamin C chuẩn có nồng độ 1000 μg/ml. Lọc dung dịch gốc qua màng lọc 0,45 μm.

Từ dung dịch chuẩn gốc tiến hành pha các dung dịch có nồng độ 50-200 μg/ml, tiếp tục lọc qua màng lọc 0,45 μm rồi cho dung dịch chuẩn vitmin C vào các vial đã ghi sẵn nồng độ, rung siêu âm các vial đã chứa mẫu để đuổi bọt khí trước khi đo HPLC.

2.5.2. Chuẩn bị các dung dịch cần khảo sát hàm lượng Vitamin C

- Lá chanh thái: Cân chính xác 7,53 gam lá chanh Thái tươi đã được xay nhỏ, cho vào cốc thủy tinh sau đó cho 10ml nước cất 2 lần, đảo đều hỗn hợp, rung siêu âm 10 phút, lọc qua giấy lọc sau đó lọc qua màng lọc 0,45 μm. Dung dịch thu được cho vào vial sau đó rung siêu âm vial chứa mẫu 10 phút để đuổi bọt khí trước khi tiến hành đo mẫu bằng máy HPLC.

rung siêu âm 10 phút, lọc qua giấy lọc sau đó lọc qua màng lọc 0,45 μm. Dung dịch thu được cho vào vial sau đó rung siêu âm vial chứa mẫu 10 phút để đuổi bọt khí trước khi tiến hành đo mẫu bằng máy HPLC.

2.5.3. Phương pháp xử lý số liệu

2.5.3.1. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp

- Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (S) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD).

    n n 2 2 i i i=1 i=1 -μ -C S = = k k C C   RSD = .100(%) C S Trong đó:

Ci: Là các giá trị nồng độ (µg/mL) của dung dịch tính được lần thứ i; : Giá trị nồng độ thực của mẫu;

C: Giá trị nồng độ trung bình tính được sau n lần xác định; k: Số bậc tự do.

2.5.3.2.Đánh giá độ đúng

Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các mẫu thuốc nghiên cứu thông qua độ thu hồi bằng phương pháp thêm chuẩn. Độ thu hồi (Rev) được tính theo công thức sau:

T C - Re = .100% a a C v Trong đó:

CT: Nồng độ của dung dịch vitamin C xác định được trong mẫu sau khi thêm chuẩn.

Ca: Nồng độ của dung dịch vitamin C xác định được trong mẫu khi chưa thêm chuẩn.

a: Nồng độ của vitamin C chuẩn thêm vào mẫu (đã biết).

2.5.3.3.Phương pháp đường chuẩn

Đường chuẩn thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ của mẫu nghiên cứu và diện tích peak tương ứng thu được, được thể hiện qua hàm bậc nhất có dạng:

b ax

y  

Trong đó:

y(V.sec): Là số đo diện tích peak

x(g/ml): Là nồng độ của mẫu nghiên cứu. a, b: Là hệ số (a,b0)

2.5.3.4.Tính kết quả

Căn cứ vào đường chuẩn để tính hàm lượng vitamin C trong mẫu theo công thức sau:

Trong đó:

V: Thể tích dịch chiết cuối cùng để chạy sắc ký HPLC (ml)

Cm: Nồng độ dung dịch chiết mẫu tính theo đường chuẩn (µg/ml). m: Khối lượng của mẫu phân tích (g)

X: Hàm lượng vitamin C trong mẫu thử (mg/100g). 100: Hệ số để tính nồng độ khối lượng trong 100g 1000: Hệ số chuyển đổi từ microgam sang miligam.

Chương 3

(V x Cm) x100 m x 1000 X =

3.1. Kết quả phân lập các hợp chất trong lá cây chanh Thái

Từ 2,5 (kg) lá cây chanh Thái khô sau khi xay nhỏ, chiết với ethanol 700, theo phương pháp ngâm kiệt (lặp lại 3 lần). Cất thu hồi dung môi thu được cặn ethanol. Sau đó phân bố đều cặn chiết này trong một lượng nước vừa đủ. Dịch chiết nước được đem chiết với n- hexan và ethylacetate.

Phần cao ethylacetate được phân lập bằng phương pháp sắc kí cột silica gel, với các hệ dung môi thích hợp thu được 2 chất sạch ký hiệu KS1, KS2.

Chất KS1 được phân lập có dạng bột, màu vàng nhạt đặc trưng cho nhóm chất flavonoid, Rf = 0,45 (CHCl3-MeOH 85:15).

Hợp chất KS2 phân lập được là chất rắn, dạng tinh thể hình kim, màu vàng, tan rất tốt trong methanol.

3.2. Kết quả xác định cấu trúc các hợp chất 3.2.1. Phân tích cấu trúc hợp chất KS1 3.2.1. Phân tích cấu trúc hợp chất KS1

Chất KS1 được tiến hành đo phổ 1H-NRM, 13C-NRM, DEPT, HSQC, HMBC và so sánh với tài liệu tham khảo để xác định công thức cấu tạo.

Trên phổ 1H- NMR (500 MHz, Acetone D6) δH (ppm) của hợp chất KS1: Xuất hiện 5 tín hiệu của proton ở vùng thơm δH 6,26 (1H; d, 2Hz); δH 6,51 (1H;

d; 2Hz); δH 6,98 (1H; d; 8,5Hz); δH 7,69 (1H; d; 8Hz); δH 7,82 (1H; d; 2Hz); một tín hiệu proton của nhóm - OH với độ dịch chuyển δH 12,15 (1H; s). Các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng này tương đối giống với các tín hiệu cộng hưởng của hợp chất quercetin.

Hình 3.1. Phổ 1H- NMR của hợp chất KS1

Phổ 13C-RMN (500 MHz, Acetone D6) δC (ppm) và phổ DEPT cho thấy hợp chất KS1 gồm 15 carbon thuộc nhân thơm bao gồm 5 carbon nhóm metin

(>CH-) và 10 nhóm carbon tứ cấp (>C<), trong đó tín hiệu carbon tại δC 176,5 đặc trưng cho nhóm carbonyl (>C=O). Từ các số liệu phổ 1H-RMN, 13C-RMN, DEPT cho phép dự đoán hợp chất KS1 thuộc loại hợp chất flavonoid

Bảng 3.1. Độ dịch chuyển hóa học của proton trên Phổ 1H-NMR của các chất KS1và quercetin[27] STT δH của quercetin [27] (δppm) δC của quercetin [27] (δppm) δH của hợp chất KS1 (δppm) δC của hợp chất KS1 (δppm) 2 147,7 146,9 3 135,7 136,7 4 176,8 176,5 5 160,7 162,3 6 6,20 (d) 98,2 6,26(d) 99,1 7 163,9 164,9 8 6,40 (d) 94,5 6,51 (d) 94,4 9 156,1 157,7 10 103,0 104,1 1’ 121,9 121,4 2’ 7,65 (d) 115,0 7,82 (d) 115,7 3’ 145,0 145,8 4’ 145,8 148,3 5’ 6,85 (d) 115,6 6,98 (d) 116,2 6’ 7,50 (dd) 124,5 7,69 (dd) 123,7 Hình 3.3. Phổ DEPT của hợp chất KS1

Trên vòng A: Carbon của nhóm carbonyl có δC 176,5 (C-4) nên C-3 gắn với nhóm (-OH kiềm) và có 1 nhóm hidroxy (-OH) gắn với C-5 vì có tín hiệu proton của nhóm -OH kiềm nối δH 12,15(1H; s).

Trên phổ HSQC thể hiện sự tương quan: δH 6,26 (1H; d; 2Hz) với δC 99,1;

δH 6,51 (1H; d; 2Hz) với δC 94,4; δH 6,98 (1H; d; 8,5Hz) với δC 116,2; δH 7,69 (1H; dd; 8Hz; 2Hz) với δC 123,7; δH7,82 (1H; d; 2Hz) với δC 115,7.

Phổ HMBC, hai proton δH 6,26 (1H; d; 2Hz) và δH 6,51 (1H; d; 2Hz) lần lượt tương quan với δC 94,4 và δC 99,1 mà không có tương quan với carbon còn lại do đó 2 proton này sẽ ở vị trí H-6 và H-8. Vì δC 99,1 tương quan với δH 12,1 nên δC 99,1 là C-6 và δH 6,26 là H-6; δC 94,4 là C-8; δH6,51 là H-8. Proton H-8 tương quan với δC 157,7 không tương quan với δC 162,3 còn H-6 tương quan với

δC 162,3 không tương quan với δC 157,7 nên δC 157,7 là C-9 và δC 162,2 là C-5. Hai carbon C-5; C-6 và δC 104,1 cùng tương quan với δH 12,1 nên δC 104,1 là C- 10. Hai proton H-6, H-8 cùng tương quan với δC 164,9 nên đây là C-7.

Trên vòng B: Từ phổ 1H-NMR và phổ HMBC ta có thể thấy lần lượt các proton δH 6.98 (1H; d; 8,5Hz, H-5’); δH 7,69 (1H; dd; 8Hz; 2Hz, H-6’); δH 7,82 (1H; d; 2Hz, H-2’) và carbon tương ứng là δC 116,2 (C-5’), δC 123,7 (C-6’), δC

115,7 (C-2’).

Phân tích phổ HMBC cho các tín hiệu H-2’ và H-5’ cùng tương quan với

δC 145,8 nhưng H-6’ lại không tương quan nên đó là C-3’. Hai proton H-2’, H- 6’ tương quan với δC 146,9 nhưng H-5’ lại không tương quan nên đó là C-2. Carbon có độ chuyển dịch δC 136,7 không tương quan với proton nào nên carbon này là C-3. Carbon δC 121,4 là C-1’; δC 148,3 là C-4’.

Hình 3.4. Tương quan phổ HMBC của hợp chất KS1

Hình 3.6. Phổ HMBC của hợp chất KS1

Như vậy, từ dữ liệu phổ 1H- NMR, 13C-RMN, HSQC, HMBC của hợp chất KS1 so sánh với dữ liệu của hợp chất quercetin đã công bố của nhóm nghiên cứu

Dihydroxyphenyl-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-one hydrate) hay còn gọi là quercetin có công thức phân tử C15H10O7 và công thức cấu tạo như hình 3.7.

Hình 3.7. Cấu trúc hợp chất quercetin

3.2.2. Phân lập cấu trúc hợp chất KS2

Cấu trúc hợp chất KS2 được xác định dựa vào phổ 1H- NMR, 13C-NMR kết hợp so sánh với các tài liệu tham khảo.

Phổ 1H- NMR (500 MHz, Acetone D6) ) δH (ppm) có sự xuất hiện tín hiệu đặc trưng của một flavonoid, trong đó proton δH 6,18 (d) ghép meta với proton δH 6,37với hằng số ghép J = 2,0Hz) tương ứng với 2 proton H-6 và H-8; ba tín hiệu cộng hưởng của 4 proton [δH , 6,18 (1H, d, 2Hz); 6,37(1H, d, 2Hz); 7,24 (2H, s), thuộc vòng A. Còn proton δH 7,24 (2H, s) được dự đoán là H-2’, H- 6’ của vòng B.

Hình 3.9. Phổ 13C- NMR của KS2

Phổ 13C-NMR (500 MHz, Acetone D6) δH (ppm) cho thấy hợp chất KS2 có 12 tín hiệu cộng hưởng ứng với 15 carbon tương tự như hợp chất KS1, trong đó δC 175,7 pm đặc trưng cho nhóm carbonyl, tín hiệu δC 135,8 (C-3) đặc trưng cho carbon nối đôi liên kết với một nhóm hydroxyl.

Bảng 3.2. Độ dịch chuyển hóa học của proton trên Phổ 1H-NMR của các chất KS2 và myricetin [34] STT δH của myricetin (δ ppm) δC của myricetin (δ ppm) δH của KS2 (δ ppm) δC của KS2 (δ ppm) 2 159,5 160,6 3 136,5 135,8 4 179.6 175,7 5 163,3 160,6 6 6,17 (1H, d) 99,9 6,18 (1H, d) 102,9 7 165,9 163,0 8 6,37 (1H, d) 94,8 6,37 (1H, d,) 90,1 9 158,7 156,0 10 105,9 102,9 1’ 121,9 120,7 2’/6’ 7,21(1H, s) 110,7 7,24(1H, s) 107,1 3’/5’ 146.9 146,0 4’ 137.9 135,0

Các giá trị phổ 1H-NMR và -13C-NMR cho phép dự đoán KS2 là hợp chất có khung flavonoid. So sánh các dữ liệu phổ cộng hưởng từ của hợp chất KS2 với các dữ liệu phổ của hợp chất myricetin đã công bố [34], chúng tôi thấy có sự tương đồng. Từ đó chúng tôi khẳng định hợp chất KS2 myricetin (CTPT C15H10O8) có công thức cấu tạo như hình 3.10.

Hình 3.10. Cấu trúc hợp chất myricetin

Các kết quả nghiên cứu về hợp chất quercetin, myricetin cho thấy đây là các hợp chất flavonoid có khả năng cải thiện sức khỏe tim mạch, chống loãng xương, chống viêm và là chất chống oxy hóa tự nhiên do có khả năng hấp thụ gốc tự do, ngoài ra myricetin còn được dùng để bảo quản thực phẩm, kéo dài thời gian sử dụng cho những thực phẩm có chứa dầu và chất béo. [11], [15]

Việc phân lập được 2 hợp chất quercetin, myricetin từ lá chanh Thái đã góp phần khẳng định thêm những tác dụng dân gian đã được sử dụng của lá chanh Thái trồng tại Champasack, miền Nam Lào.

3.3. Xác định hàm lượng vitamin C trong lá và quả chanh Thái 3.3.1. Khảo sát điều kiện nghiên cứu 3.3.1. Khảo sát điều kiện nghiên cứu

Dựa vào kết quả nghiên cứu tài liệu [4] kết hợp khảo sát với mẫu chuẩn và mẫu thực chúng tôi lựa chọn điều kiện tối ưu cho phép xác định vitamin C trong lá và quả chanh Thái bằng phương pháp HPLC:

 Cột tách: cột C18.  Detector UV-Vis: λ = 248,3 nm.  Tốc độ dòng chảy: 0,8 mL/phút.  Thể tích bơm mẫu: 10 µL.  Nhiệt độ phân tích: 300C.  Pha động: CH3OH - KH2PO4 1% (v/v =15:85).

 Thời gian chạy đối với mẫu vitamin C chuẩn là 10 phút, với mẫu cần khảo sát là 30 phút.

Hình 3.11. Sắc kí đồ 3D khảo sát bước sóng thích hợp của hợp chất vitamin C

3.3.2. Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống

Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với dung dịch vitamin C chuẩn (5 lần). Kết quả được thể hiện trên hình 3.12 và bảng 3.3.

V it a m in C - 3 .2 6 7 AU 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00

Các kết quả sắc ký đồ đều cho thấy xuất hiện 1 peak có hình ảnh sắc nhọn, cân đối tại thời gian lưu 3,267 phút, do thời gian lưu ngắn nên tiết kiệm

được thời gian và dung môi trong quá trình phân tích.

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký

Mẫu Thời gian lưu (phút) Diện tích peak (mAu x phút)

1 3,267 1010167 2 3,266 1001279 3 3,269 1011810 4 3,267 1011774 5 3,268 994052 Số liệu thống