CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Lấy mẫu cây Màng tang
Mẫu cây Màng tang đƣợc lấy bằng dao đã khử trùng và lƣu giữ trong các túi nilon. Mẫu cây Màng tang đƣợc chia thành 3 phần riêng: rễ, thân, lá đựng trong túi nilon sạch có ghi đặc điểm và địa điểm lấy mẫu. Mẫu đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC cho đến khi xử lí và phân tích trong vòng 20 ngày.
2.2.2. Phương pháp xử lý bề mặt mẫu
Mẫu cây Màng tang đƣợc rửa sạch dƣới vòi nƣớc để loại bỏ đất, tạp chất và làm khô mẫu tại nhiệt độ phòng trong 20 phút. Các mẫu đƣợc khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong NaClO 5,0% (v/v) từ trong 5 phút. Rửa mẫu một lần bằng Na2S2O3 2,0% (w/v) trong 1 phút để loại bỏ NaClO dƣ. Tiếp tục xử lý mẫu bằng Ethanol 70% trong 10 phút, rửa lại bằng nƣớc cất khử trùng để loại bỏ Ethanol. Tiến hành nghiền mẫu trong tủ cấy vô trùng [63].
Bổ sung các hợp chất kháng sinh nhƣ acid nalidixic (15 mg/mL) và nystatin (15 mg/mL) vào 8 loại môi trƣờng phân lập để nâng cao tính chọn lọc xạ khuẩn và ức chế phát triển của vi khuẩn và nấm nội sinh.
2.2.3. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn
Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn nội sinh đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch kết hợp hiệu chỉnh theo phƣơng pháp đã đƣợc mô tả trƣớc đây [2], [21]. Chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng YIM38 ở nhiệt độ 30o
C trên máy lắc tốc độ 200 vòng/phút trong 5 ngày. Môi trƣờng thạch LB sau khi khử trùng xong để nguội đến nhiệt độ 30-37oC, hút dịch vi sinh vật kiểm định có mật độ tế bào đạt 5.108 CFU/ml lên trên bề mặt đĩa Petri hoặc các khay. Khi thạch đông dùng dụng cụ đục lỗ thạch vô trùng đục lỗ và lấy các thỏi thạch ra. Sau 5 ngày nuôi cấy, thu hồi và ly tâm dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn với tốc độ 6.000-8.000 vòng/phút ở 4oC. Bổ sung 100 μL dịch vào các giếng thạch trên đĩa Petri và đặt các đĩa trong tủ lạnh khoảng 5-6 giờ để dịch từ các giếng
khuếch tán ra môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật. Sau đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 28-30oC trong 14-18 giờ, quan sát vòng kháng khuẩn.
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đƣợc xác định theo kích thƣớc vòng kháng khuẩn (Vkk) theo công thức:
Vkk = D - d (mm),
Trong đó: D: Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (mm) d: Đƣờng kính lỗ thạch (mm)
2.2.4. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của xạ khuẩn
Các chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng YIM 61, sau 72 giờ nuôi cấy, ly tâm thu tế bào ở 10.000 vòng/phút trong 5 phút. DNA tổng số đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp của Sambrook và Russell [56]. Gen mã hóa các enzyme đóng vai trò chính trong sản phẩm trao đổi chất thứ cấp đƣợc khuếch đại bắng phản ứng PCR đựa trên 3 cặp mồi đặc hiệu cho pks-I
(K1F/M6R); pks-II (KsaF/KsaR); nrps (A3F/A7R) theo chu trình nhiệt: 95oC trong 5 phút, 30 chu trình: 94oC trong 60 giây, 57oC (K1F⁄M6R, A3F⁄A7R) hay 58oC (KSaF⁄KSaR) trong 90 giây, 72o
C trong 60 giây, 72oC trong 10 phút, giữ mẫu ở 4oC [36]. Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%.
2.2.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT28
2.2.5.1. Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khả năng sinh melanin
Đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn đƣợc quan sát, so sánh trên các môi trƣờng ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, ISP6, ISP7 ở nhiệt độ 28-30o
C [1]. Sau 7, 14 và 21 ngày lấy mẫu quan sát màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tan trên môi trƣờng theo phƣơng pháp của Shirling và Gottlieb (1966) và trên bảng màu của Tresner và Danga (1958) [58], [68].
- Màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS): Màu sắc của khuẩn ty khí sinh đƣợc so với 7 nhóm màu: xanh da trời, sẫm, xám, đỏ, tím, trắng, vàng [68].
- Màu sắc của khuẩn ty cơ chất (KTCC): Chia vào 5 nhóm vàng-nâu (gồm cả các loại không tiết sắc tố); xanh da trời; xanh lá; đỏ-da cam; tím.
- Khả năng sinh sắc tố tan: đƣợc xác định trên môi trƣờng ISP2, ISP5. Sắc tố tan đƣợc xếp vào 5 nhóm: vàng nâu; xanh da trời; xanh lá; đỏ da cam; tím.
- Sự hình thành sắc tố melanin: để kiểm tra khả năng hình thành melanin xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ISP1, ISP6 và ISP7 ở nhiệt độ thích hợp. Quan sát trong 14 ngày, nếu chủng sinh ra melanin thì màu của môi trƣờng sẽ chuyển từ vàng nhạt sang nâu, đen.
2.2.5.2. Quan sát đặc điểm cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử
Xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ISP3 và ISP4 có đặt lamen trên mặt đĩa. Sau 7, 14 và 21 ngày nuôi ở nhiệt độ 28-30oC xạ khuẩn phát triển tốt lấy ra quan sát hình dạng chuỗi bào tử dƣới kính hiển vi quang học và kính hiển vi quét.
- Hình dạng chuỗi bào tử đƣợc ký hiệu: RF (thẳng hay hơi lƣợn sóng); RA (hình móc câu hay xoắn không hoàn toàn); S (dạng xoắn lò xo hay xoắn hoàn toàn); SRF (dạng xoắn lƣợn sóng); SRA (dạng xoắn có móc câu) [49].
- Bề mặt bào tử: các mẫu đƣợc đông khô, sau đó đƣợc mạ vàng bằng máy JFC-1200, quan sát và chụp trên kính hiển vị điện tử quét (JSM-5410; JEOL, Tokyo) với điện áp là 15 kv để xác định đặc điểm bề mặt bào tử: Sm (trơn nhẵn), sp (gai), wa (xù xì), ru (nếp nhăn), ha (tóc).
2.2.5.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
- Khả năng sử dụng nguồn carbon: Xạ khuẩn đƣợc nuôi ở nhiệt độ 28- 30oC trên môi trƣờng ISP9 có bổ sung các nguồn đƣờng (1,0%, w/v): D- Glucose, D-Glactose, D-Mantose, L-Arabinose, α-Lactose, myo-Inositol, D- Manitol... Sau 7-14 ngày quan sát sự sinh trƣởng và so sánh với môi trƣờng có nguồn cacbon là D-Glucose (đối chứng dƣơng) và không có nguồn cacbon (đối chứng âm) [26].
- Khả năng sử dụng nguồn nitơ: Xạ khuẩn đƣợc nuôi ở nhiệt độ 28-30oC trên môi trƣờng ISP8 có bổ sung các nguồn nitơ (1,0%, w/v): L-Histidine monohydrat, L- Phenylalanin, L-Arginin, L-Lysin, L-Threonin, L-Cystein...
Sau 7-14 ngày quan sát sự sinh trƣởng, so sánh với ống đối chứng âm (môi trƣờng ISP9) và đối chứng dƣơng (môi trƣờng có L-Asparagin monohydrat).
- Xác định nhiệt độ, pH nuôi cấy thích hợp: Chủng MPT28 đƣợc nuôi trên môi trƣờng thạch Bennett ở các nhiệt độ khác nhau (15o
C; 30oC; 37oC; 45oC) và pH 3,0-12,0. Sau 5-7 ngày nuôi cấy, quan sát sự sinh trƣởng của xạ khuẩn.
- Xác định nồng độ NaCl thích hợp: chủng MPT28 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Bennett thạch có bổ sung NaCl với nồng độ tăng dần từ 1,0-10,0% (w/v) ở 30o
C, sau 5-7 ngày nuôi cấy, quan sát sự sinh trƣởng của xạ khuẩn.
2.2.6. Phân loại chủng xạ khuẩn MPT28 dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA 16S rDNA
Trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F và 1429R có trình tự nhƣ trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA
Tên đoạn mồi Trình tự mồi
27F 5‟-TAACACATGCAAGTCGAACG-3‟
1429R 5‟-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3‟
Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%. Kích thƣớc của các đoạn DNA thu đƣợc sau phản ứng PCR đƣợc so sánh với thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ). Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM
– DNA Purification (Invitrogen, Mỹ) và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, Mỹ) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trình tự gen 16S rDNA đƣợc so sánh với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank (NCBI) nhờ công cụ BLAST.
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả nghiên cứu đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê sinh học trên phần mềm excel. Phần mềm sử dụng các hàm tính toán dựa trên những công thức cơ bản của thống kê trong đó có công thức:
Giá trị trung bình ( ): Độ lệch chuẩn ( ): Sai số m: