Nhằm đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp của các nhóm xạ khuẩn khác nhau, oligonucleotide primer đƣợc thiết kế, khuếch đại vùng KS và A nhằm sàng lọc gen kháng sinh về mặt di truyền và nghiên cứu đa dạng của gen pks-
I, pks-II, nrps. Sacido và Genilloud (2003) đã nghiên cứu đa dạng của gen
pks-I, pks-II, nrps trong 210 chủng đại diện thuộc 33 chi xạ khuẩn (Bảng 1.4).
Bảng 1.4. Tần xuất xuất hiện gen pks-I, nrps trong các phân nhóm xạ khuẩn khác nhau
Phân nhóm Tổng số
chủng
Gen nrps Gen pks-I
Số lƣợng (chủng) Tỷ lệ (%) Số lƣợng (chủng) Tỷ lệ (%) Actinomycetales 210 167 79,5 119 56,7 Streptomycetaceae 33 32 97,0 26 78,8 Micromonosporaceae 65 50 76,9 31 47,7 Nocardiaceae 22 20 90,9 13 59,0 Pseudonocardiaceae 37 29 76,3 20 52,6 Nocardiopsaceae 6 4 66,7 3 27,3 Actinosynnemataceae 13 13 100 8 61,5 Thermomonosporaceae 8 5 62,5 3 37,5 Streptosporangiaceae 20 13 65,0 4 20,0 Glycomycetaceae 3 2 66,7 0 0 Geothermatophilaceae 3 0 0 1 33,3
Theo đó, trình tự gen nrps phân bố rộng rãi và chiếm tỷ lệ cao nhất, đạt 79,5%; trình tự pks-I chiếm tỷ lệ thấp hơn (56,7%). Trình tự pks-I, pks-II, nrps
đƣợc phát hiện ở hầu hết các chủng thuộc chi Streptomyces (khoảng 97% và 79%), nhƣng sự phân bố của nhóm gen này biến động mạnh trong các chi còn lại [55].
Gen nrps xuất hiện hầu hết trong các chủng thuộc nhóm
Micromonosporaceae (50-100%) nhƣng đối với các chủng thuộc chi
Micromonospora và Catenuloplanes thì gen pks-I lần lƣợt đạt 68% và 60%. Hơn nữa, gen pks-I không đƣợc tìm thấy trong chi Catellatospora. Ngƣợc lại, gen pks-I, pks-II, nrps đƣợc phát hiện trong họ Pseudonocardiaceae (chiếm 76,3% và 52,6%) với tỷ lệ cao trong các chi nhƣ: Amycolatopsis,
Saccharopolyspora và Saccharomonospora. Ngoài ra, pks-I và nrps ít xuất hiện trong chi Pseudonocardia mặc dù tỷ lệ các chủng đƣợc phân tích cao [55].
Trong các chủng thuộc họ Actinosynnemataceae, tỷ lệ pks-I, nrps đƣợc phát hiện lần lƣợt đạt 100% và 61,5% trên tổng số các chủng đƣợc kiểm tra, mặc dù chỉ có một số đại diện là các chi Actinokineospora, Lechevalieria, Saccharothrix, Lentzea, và Actinosynnema. Đặc biệt, pks-I và nrps phân bố với tỷ lệ thấp trong các chủng thuộc họ Streptosporangiaceae (khoảng 65% và 20%) và không xuất hiện ở các họ Nocardiopsaceae, Thermomonosporaceae, Glycomycetaceae, và Geodermatophilaceae.
Cả hai trình tự này xuất hiện chủ yếu trong những chủng thuộc các chi nhƣ Streptomyces hoặc các họ Micromonosporaceae, Pseudonocardiaceae và
Actinosynnemataceae. Các chi trên có gen mã hóa NRPS có khả năng sinh tổng hợp vancomycin hoặc các hợp chất polyketide nhƣ erythromycin hoặc spinosin. Tuy nhiên, những trình tự này cũng đƣợc phát hiện trong một số chủng không sản xuất kháng sinh cũng nhƣ các chủng xạ khuẩn hiếm.
1.3.3. Chất kháng sinh và kháng sinh điều trị ung thư nhóm anthracycline
Hiện nay, anthracycline là nhóm kháng sinh đƣợc sử dụng rộng rãi trong điều trị ung thƣ. Vào những năm 1960, anthracycline đƣợc phát hiện từ chất màu của chủng xạ khuẩn S. peucetius, gồm 2 phân nhóm doxorubicin (DOX1) và daunorubicin (DNR) [27].
Hình 1.1. Cấu trúc của một số kháng sinh điển hình thuộc nhóm anthracycline: DOX, DNR, EPI và IDA
Về công thức cấu tạo, DOX và DNR có cấu trúc gồm các aglyconic và các gốc đƣờng khác nhau (Hình 1.1). Các aglyconic bao gồm vòng tetracyclic liên kết với các nhóm quinone-hydroquinone trong vòng ký hiệu C và B, trong đó gốc methoxy thay thế C-4 trong vòng D và một gốc carbonyl đƣợc gắn vào vị trí C-9, C-13. Các gốc đƣờng khi gắn nhóm glycosyl và 3-amino- 2,3,6-trideoxy-L-fucosyl ở vị trí C-7 nằm trên vòng A đƣợc gọi là daunosamine. Sự khác nhau chính giữa DOX và DNR là chuỗi của DOX bị kết thúc ở gốc alcohol, còn DNR kết thúc ở gốc methyl. Chính sự khác biệt này tạo nên sự khác nhau về phổ hoạt động của DOX và DNR. DOX là thành phần thiết yếu trong điều trị ung thƣ vú, hình thành các khối u, ung thƣ hạch bạch huyết. Trong khi đó, DNR có tác dụng trong điều trị bệnh bạch cầu cấp tính. Tuy nhiên, DOX và DNR gây tác dụng phụ nhƣ gây ra bệnh đau cơ tim mãn tính hay suy tim [27].
Việc tìm kiếm chất anthracycline mới có ứng dụng trong thử nghiệm lâm sàng đã thôi thúc các nhà khoa học biến đổi cấu trúc hóa học hoặc thay đổi vòng tetracyclic, aminosugar. Kết quả đã tạo ra hai loại chất kháng ung
thƣ tổng hợp mới là Epirubicin (EPI) và Idarubicin (IDA). EPI là doxorubicin đƣợc epimer hóa tại vị trí C-4 hydroxyl trên phân tử đƣờng. EPI đƣợc sử dụng trong điều trị ung thƣ dạ dày, ung thƣ vú, nội mạc tử cung, phổi, buồng trứng và ung thƣ tuyến tiền liệt…
IDA là dẫn xuất của daunorubicin, bị khuyết thiếu nhóm methoxy tại vị trí C-4 dẫn đến làm tăng khả năng hòa tan trong chất béo, dung môi cũng nhƣ hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ. So với DNR, IDA có nhiều ƣu điểm hơn DNR trong điều trị bệnh bạch cầu nguyên bào tủy cấp tính. Hiện tại, cơ chế mà nhóm anthracycline ức chế tế bào ung thƣ vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ [27].
1.4. Cây Màng tang và tiềm năng khai thác xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang
Cây Màng tang (Litsea cubeba) mọc hoang ở các vùng núi cao của Hà Giang, Yên Bái, Điện Biên, Gia Lai, Kon Tum, Đà Lạt. Màng tang có vị cay thơm, tính ẩm, tán trong hàn, ôn trung hạ khí chữa cảm lạnh, nhức đầu, tê thấp, nhức xƣơng tay chân tê dại. Quả Màng tang dùng làm thuốc bổ dạ dày, thông tiêu hóa và chữa bệnh đau đầu. Rễ và lá Màng tang còn dùng để chữa rắn cắn, trị nhọt, viêm mủ trên da, tinh dầu có tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng vi sinh vật kiểm định và kháng tế bào ung thƣ [6].
Cây Màng tang đƣợc biết đến nhƣ một vị thuốc dùng chữa những trƣờng hợp nhƣ nhức đầu, đau dạ dày, khó tiêu, phong thấp đau nhức xƣơng, quáng gà... Tinh dầu Màng tang đƣợc chứng minh có khả năng kháng khuẩn (Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli); kháng nấm (Sclerotinia sclerotiorum, Thanatephorus cucumeris, Colletotrichum gloeosporioides); chống ôxi hóa, kháng tế bào ung thƣ (gan, phổi, miệng)... [31], [38]. Năm 2010, Ho và cộng sự có công bố đầu tiên xác định 50 hợp chất từ quả Màng tang thu thập tại Đài Loan, chất citral chiếm 68,9% tinh dầu chiết xuất từ quả và ức chế các dòng tế bào ung thƣ OEC-M1, J5, A549 với giá trị IC50 đạt lần lƣợt 50, 50 và 100ppm. [31]. Nối tiếp nghiên cứu trên Zhang và cộng sự (2012) đã tách chiết 5 hợp chất mới có khả năng
kháng khuẩn thuộc nhóm isoquinoline alkaloid có độ tinh sạch > 90% từ thân cây Màng tang thu thập tại Quý Châu, Trung Quốc. Ngoài khả năng kháng vi khuẩn và nấm gây bệnh, chất (+)-N-(methoxylcarbonyl)-N-norbulbodione, (+)-N-(methoxylcarbonyl)-N norisocorydione có hoạt tính ức chế 6 dòng tế bào ung thƣ với giá trị IC50 đạt lần lƣợt 9,54-12,22µM và 9,83-11,96µM. [71]. Các hợp chất chiết xuất từ quả Màng tang đƣợc chứng minh hoạt tính kháng vi khuẩn Streptococcus mutans, S. sobrinus gây sâu răng và kìm hãm quá trình hỏng của thực phẩm, hạn chế sự tăng sinh một số dòng tế bào ung thƣ gan, phổi, vú [70].
Cho đến nay, chƣa có nhiều công trình nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang đƣợc công bố trên thế giới cũng nhƣ Việt Nam. Do vậy, nghiên cứu về VSV nói chung và xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại Việt Nam giúp cung cấp các số liệu tham khảo cho các nhà khoa học trong và ngoài nƣớc.
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Mẫu cây Màng tang, chủng giống vi sinh vật
Ba mẫu (rễ, thân, lá) cây Màng tang đƣợc thu thập tại xã Cấp Dẫn, huyện Cẩm Khê, tỉnh Phú Thọ, Việt Nam (21o24‟25‟‟N;105o04‟05‟‟E) vào tháng 1 năm 2016.
Các chủng vi sinh vật kiểm định: Salmonella enterica ATCC 14028,
Escherichia coli ATCC 11105, Sarcina lutea CNLM, Bacillus cereus ATCC 11778, Proteus vulgaris CNLM, Pseudomonas aeruginosa CNLM,
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Enterobacter aerogenes ATCC 13048 nhận từ Bộ sƣu tập giống VSV của Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.2. Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu
Hóa chất: Cao malt (Himedia-Ấn Độ); Cao nấm men (Himedia-Ấn Độ); Raffinose (Chameleon, Nhật Bản) Trehalose (Chameleon, Nhật Bản); Sodium dodecyl sulfate (SDS); Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) (BioLabs, Mỹ); Phenol, Methanol, Isoamylalcohol, EtBr, Glycerol, Ethanol, Chloroform, Ampicillin, Acrylamide, (Merck, Đức); Agar (Fluka, Đức); d- NTP (Fermentas, Mỹ), bộ kit tinh sạch DNA từ gel agarose của Thermo scientific (Mỹ)...
Enzyme: RNAase; Taq DNA polymerase (Thermo scientific, Mỹ). Thiết bị nghiên cứu: Máy PCR (GeneAmp® PCR System 9700, Applied Biosystems, Mỹ), máy ly tâm lạnh (Biofuge fresco, Kendro, Đức); máy điện di DNA (Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy UV (PowerPac Basic, Bio-Rad, Mỹ); máy lắc ổn nhiệt (BSI-25R CPT, Mỹ) và một số thiết bị nghiên cứu khác.
2.1.3. Môi trường nuôi cấy
Các môi trƣờng đƣợc sử dụng trong lƣu giữ giống, phân lập và xác định đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh đƣợc trình bày trong Phụ lục 1.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Lấy mẫu cây Màng tang
Mẫu cây Màng tang đƣợc lấy bằng dao đã khử trùng và lƣu giữ trong các túi nilon. Mẫu cây Màng tang đƣợc chia thành 3 phần riêng: rễ, thân, lá đựng trong túi nilon sạch có ghi đặc điểm và địa điểm lấy mẫu. Mẫu đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC cho đến khi xử lí và phân tích trong vòng 20 ngày.
2.2.2. Phương pháp xử lý bề mặt mẫu
Mẫu cây Màng tang đƣợc rửa sạch dƣới vòi nƣớc để loại bỏ đất, tạp chất và làm khô mẫu tại nhiệt độ phòng trong 20 phút. Các mẫu đƣợc khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong NaClO 5,0% (v/v) từ trong 5 phút. Rửa mẫu một lần bằng Na2S2O3 2,0% (w/v) trong 1 phút để loại bỏ NaClO dƣ. Tiếp tục xử lý mẫu bằng Ethanol 70% trong 10 phút, rửa lại bằng nƣớc cất khử trùng để loại bỏ Ethanol. Tiến hành nghiền mẫu trong tủ cấy vô trùng [63].
Bổ sung các hợp chất kháng sinh nhƣ acid nalidixic (15 mg/mL) và nystatin (15 mg/mL) vào 8 loại môi trƣờng phân lập để nâng cao tính chọn lọc xạ khuẩn và ức chế phát triển của vi khuẩn và nấm nội sinh.
2.2.3. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn
Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn nội sinh đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch kết hợp hiệu chỉnh theo phƣơng pháp đã đƣợc mô tả trƣớc đây [2], [21]. Chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng YIM38 ở nhiệt độ 30o
C trên máy lắc tốc độ 200 vòng/phút trong 5 ngày. Môi trƣờng thạch LB sau khi khử trùng xong để nguội đến nhiệt độ 30-37oC, hút dịch vi sinh vật kiểm định có mật độ tế bào đạt 5.108 CFU/ml lên trên bề mặt đĩa Petri hoặc các khay. Khi thạch đông dùng dụng cụ đục lỗ thạch vô trùng đục lỗ và lấy các thỏi thạch ra. Sau 5 ngày nuôi cấy, thu hồi và ly tâm dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn với tốc độ 6.000-8.000 vòng/phút ở 4oC. Bổ sung 100 μL dịch vào các giếng thạch trên đĩa Petri và đặt các đĩa trong tủ lạnh khoảng 5-6 giờ để dịch từ các giếng
khuếch tán ra môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật. Sau đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 28-30oC trong 14-18 giờ, quan sát vòng kháng khuẩn.
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đƣợc xác định theo kích thƣớc vòng kháng khuẩn (Vkk) theo công thức:
Vkk = D - d (mm),
Trong đó: D: Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (mm) d: Đƣờng kính lỗ thạch (mm)
2.2.4. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của xạ khuẩn
Các chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng YIM 61, sau 72 giờ nuôi cấy, ly tâm thu tế bào ở 10.000 vòng/phút trong 5 phút. DNA tổng số đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp của Sambrook và Russell [56]. Gen mã hóa các enzyme đóng vai trò chính trong sản phẩm trao đổi chất thứ cấp đƣợc khuếch đại bắng phản ứng PCR đựa trên 3 cặp mồi đặc hiệu cho pks-I
(K1F/M6R); pks-II (KsaF/KsaR); nrps (A3F/A7R) theo chu trình nhiệt: 95oC trong 5 phút, 30 chu trình: 94oC trong 60 giây, 57oC (K1F⁄M6R, A3F⁄A7R) hay 58oC (KSaF⁄KSaR) trong 90 giây, 72o
C trong 60 giây, 72oC trong 10 phút, giữ mẫu ở 4oC [36]. Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%.
2.2.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT28
2.2.5.1. Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khả năng sinh melanin
Đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn đƣợc quan sát, so sánh trên các môi trƣờng ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, ISP6, ISP7 ở nhiệt độ 28-30o
C [1]. Sau 7, 14 và 21 ngày lấy mẫu quan sát màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tan trên môi trƣờng theo phƣơng pháp của Shirling và Gottlieb (1966) và trên bảng màu của Tresner và Danga (1958) [58], [68].
- Màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS): Màu sắc của khuẩn ty khí sinh đƣợc so với 7 nhóm màu: xanh da trời, sẫm, xám, đỏ, tím, trắng, vàng [68].
- Màu sắc của khuẩn ty cơ chất (KTCC): Chia vào 5 nhóm vàng-nâu (gồm cả các loại không tiết sắc tố); xanh da trời; xanh lá; đỏ-da cam; tím.
- Khả năng sinh sắc tố tan: đƣợc xác định trên môi trƣờng ISP2, ISP5. Sắc tố tan đƣợc xếp vào 5 nhóm: vàng nâu; xanh da trời; xanh lá; đỏ da cam; tím.
- Sự hình thành sắc tố melanin: để kiểm tra khả năng hình thành melanin xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ISP1, ISP6 và ISP7 ở nhiệt độ thích hợp. Quan sát trong 14 ngày, nếu chủng sinh ra melanin thì màu của môi trƣờng sẽ chuyển từ vàng nhạt sang nâu, đen.
2.2.5.2. Quan sát đặc điểm cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử
Xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ISP3 và ISP4 có đặt lamen trên mặt đĩa. Sau 7, 14 và 21 ngày nuôi ở nhiệt độ 28-30oC xạ khuẩn phát triển tốt lấy ra quan sát hình dạng chuỗi bào tử dƣới kính hiển vi quang học và kính hiển vi quét.
- Hình dạng chuỗi bào tử đƣợc ký hiệu: RF (thẳng hay hơi lƣợn sóng); RA (hình móc câu hay xoắn không hoàn toàn); S (dạng xoắn lò xo hay xoắn hoàn toàn); SRF (dạng xoắn lƣợn sóng); SRA (dạng xoắn có móc câu) [49].
- Bề mặt bào tử: các mẫu đƣợc đông khô, sau đó đƣợc mạ vàng bằng máy JFC-1200, quan sát và chụp trên kính hiển vị điện tử quét (JSM-5410; JEOL, Tokyo) với điện áp là 15 kv để xác định đặc điểm bề mặt bào tử: Sm (trơn nhẵn), sp (gai), wa (xù xì), ru (nếp nhăn), ha (tóc).
2.2.5.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
- Khả năng sử dụng nguồn carbon: Xạ khuẩn đƣợc nuôi ở nhiệt độ 28- 30oC trên môi trƣờng ISP9 có bổ sung các nguồn đƣờng (1,0%, w/v): D- Glucose, D-Glactose, D-Mantose, L-Arabinose, α-Lactose, myo-Inositol, D- Manitol... Sau 7-14 ngày quan sát sự sinh trƣởng và so sánh với môi trƣờng có nguồn cacbon là D-Glucose (đối chứng dƣơng) và không có nguồn cacbon (đối chứng âm) [26].
- Khả năng sử dụng nguồn nitơ: Xạ khuẩn đƣợc nuôi ở nhiệt độ 28-30oC trên môi trƣờng ISP8 có bổ sung các nguồn nitơ (1,0%, w/v): L-Histidine monohydrat, L- Phenylalanin, L-Arginin, L-Lysin, L-Threonin, L-Cystein...
Sau 7-14 ngày quan sát sự sinh trƣởng, so sánh với ống đối chứng âm (môi trƣờng ISP9) và đối chứng dƣơng (môi trƣờng có L-Asparagin monohydrat).
- Xác định nhiệt độ, pH nuôi cấy thích hợp: Chủng MPT28 đƣợc nuôi trên môi trƣờng thạch Bennett ở các nhiệt độ khác nhau (15o
C; 30oC; 37oC; 45oC) và pH 3,0-12,0. Sau 5-7 ngày nuôi cấy, quan sát sự sinh trƣởng của xạ khuẩn.
- Xác định nồng độ NaCl thích hợp: chủng MPT28 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Bennett thạch có bổ sung NaCl với nồng độ tăng dần từ 1,0-10,0% (w/v) ở 30o
C, sau 5-7 ngày nuôi cấy, quan sát sự sinh trƣởng của xạ khuẩn.
2.2.6. Phân loại chủng xạ khuẩn MPT28 dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA 16S rDNA
Trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F và 1429R có trình tự nhƣ trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA
Tên đoạn mồi Trình tự mồi
27F 5‟-TAACACATGCAAGTCGAACG-3‟
1429R 5‟-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3‟
Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%. Kích thƣớc của các đoạn DNA thu đƣợc sau phản ứng PCR đƣợc so sánh với thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ). Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM
– DNA Purification (Invitrogen, Mỹ) và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, Mỹ) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trình tự gen 16S rDNA đƣợc so sánh với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank (NCBI) nhờ công cụ BLAST.
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả nghiên cứu đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê sinh học trên phần mềm excel. Phần mềm sử dụng các hàm tính toán dựa trên những