Mẫu cây Màng tang đƣợc lấy bằng dao đã khử trùng và lƣu giữ trong các túi nilon. Mẫu cây Màng tang đƣợc chia thành 3 phần riêng: rễ, thân, lá đựng trong túi nilon sạch có ghi đặc điểm và địa điểm lấy mẫu. Mẫu đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC cho đến khi xử lí và phân tích trong vòng 20 ngày.
2.2.2. Phương pháp xử lý bề mặt mẫu
Mẫu cây Màng tang đƣợc rửa sạch dƣới vòi nƣớc để loại bỏ đất, tạp chất và làm khô mẫu tại nhiệt độ phòng trong 20 phút. Các mẫu đƣợc khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong NaClO 5,0% (v/v) từ trong 5 phút. Rửa mẫu một lần bằng Na2S2O3 2,0% (w/v) trong 1 phút để loại bỏ NaClO dƣ. Tiếp tục xử lý mẫu bằng Ethanol 70% trong 10 phút, rửa lại bằng nƣớc cất khử trùng để loại bỏ Ethanol. Tiến hành nghiền mẫu trong tủ cấy vô trùng [63].
Bổ sung các hợp chất kháng sinh nhƣ acid nalidixic (15 mg/mL) và nystatin (15 mg/mL) vào 8 loại môi trƣờng phân lập để nâng cao tính chọn lọc xạ khuẩn và ức chế phát triển của vi khuẩn và nấm nội sinh.
2.2.3. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn
Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn nội sinh đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch kết hợp hiệu chỉnh theo phƣơng pháp đã đƣợc mô tả trƣớc đây [2], [21]. Chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng YIM38 ở nhiệt độ 30o
C trên máy lắc tốc độ 200 vòng/phút trong 5 ngày. Môi trƣờng thạch LB sau khi khử trùng xong để nguội đến nhiệt độ 30-37oC, hút dịch vi sinh vật kiểm định có mật độ tế bào đạt 5.108 CFU/ml lên trên bề mặt đĩa Petri hoặc các khay. Khi thạch đông dùng dụng cụ đục lỗ thạch vô trùng đục lỗ và lấy các thỏi thạch ra. Sau 5 ngày nuôi cấy, thu hồi và ly tâm dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn với tốc độ 6.000-8.000 vòng/phút ở 4oC. Bổ sung 100 μL dịch vào các giếng thạch trên đĩa Petri và đặt các đĩa trong tủ lạnh khoảng 5-6 giờ để dịch từ các giếng
khuếch tán ra môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật. Sau đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 28-30oC trong 14-18 giờ, quan sát vòng kháng khuẩn.
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đƣợc xác định theo kích thƣớc vòng kháng khuẩn (Vkk) theo công thức:
Vkk = D - d (mm),
Trong đó: D: Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (mm) d: Đƣờng kính lỗ thạch (mm)
2.2.4. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của xạ khuẩn
Các chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng YIM 61, sau 72 giờ nuôi cấy, ly tâm thu tế bào ở 10.000 vòng/phút trong 5 phút. DNA tổng số đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp của Sambrook và Russell [56]. Gen mã hóa các enzyme đóng vai trò chính trong sản phẩm trao đổi chất thứ cấp đƣợc khuếch đại bắng phản ứng PCR đựa trên 3 cặp mồi đặc hiệu cho pks-I
(K1F/M6R); pks-II (KsaF/KsaR); nrps (A3F/A7R) theo chu trình nhiệt: 95oC trong 5 phút, 30 chu trình: 94oC trong 60 giây, 57oC (K1F⁄M6R, A3F⁄A7R) hay 58oC (KSaF⁄KSaR) trong 90 giây, 72o
C trong 60 giây, 72oC trong 10 phút, giữ mẫu ở 4oC [36]. Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%.
2.2.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT28
2.2.5.1. Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khả năng sinh melanin
Đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn đƣợc quan sát, so sánh trên các môi trƣờng ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, ISP6, ISP7 ở nhiệt độ 28-30o
C [1]. Sau 7, 14 và 21 ngày lấy mẫu quan sát màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tan trên môi trƣờng theo phƣơng pháp của Shirling và Gottlieb (1966) và trên bảng màu của Tresner và Danga (1958) [58], [68].
- Màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS): Màu sắc của khuẩn ty khí sinh đƣợc so với 7 nhóm màu: xanh da trời, sẫm, xám, đỏ, tím, trắng, vàng [68].
- Màu sắc của khuẩn ty cơ chất (KTCC): Chia vào 5 nhóm vàng-nâu (gồm cả các loại không tiết sắc tố); xanh da trời; xanh lá; đỏ-da cam; tím.
- Khả năng sinh sắc tố tan: đƣợc xác định trên môi trƣờng ISP2, ISP5. Sắc tố tan đƣợc xếp vào 5 nhóm: vàng nâu; xanh da trời; xanh lá; đỏ da cam; tím.
- Sự hình thành sắc tố melanin: để kiểm tra khả năng hình thành melanin xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ISP1, ISP6 và ISP7 ở nhiệt độ thích hợp. Quan sát trong 14 ngày, nếu chủng sinh ra melanin thì màu của môi trƣờng sẽ chuyển từ vàng nhạt sang nâu, đen.
2.2.5.2. Quan sát đặc điểm cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử
Xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ISP3 và ISP4 có đặt lamen trên mặt đĩa. Sau 7, 14 và 21 ngày nuôi ở nhiệt độ 28-30oC xạ khuẩn phát triển tốt lấy ra quan sát hình dạng chuỗi bào tử dƣới kính hiển vi quang học và kính hiển vi quét.
- Hình dạng chuỗi bào tử đƣợc ký hiệu: RF (thẳng hay hơi lƣợn sóng); RA (hình móc câu hay xoắn không hoàn toàn); S (dạng xoắn lò xo hay xoắn hoàn toàn); SRF (dạng xoắn lƣợn sóng); SRA (dạng xoắn có móc câu) [49].
- Bề mặt bào tử: các mẫu đƣợc đông khô, sau đó đƣợc mạ vàng bằng máy JFC-1200, quan sát và chụp trên kính hiển vị điện tử quét (JSM-5410; JEOL, Tokyo) với điện áp là 15 kv để xác định đặc điểm bề mặt bào tử: Sm (trơn nhẵn), sp (gai), wa (xù xì), ru (nếp nhăn), ha (tóc).
2.2.5.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
- Khả năng sử dụng nguồn carbon: Xạ khuẩn đƣợc nuôi ở nhiệt độ 28- 30oC trên môi trƣờng ISP9 có bổ sung các nguồn đƣờng (1,0%, w/v): D- Glucose, D-Glactose, D-Mantose, L-Arabinose, α-Lactose, myo-Inositol, D- Manitol... Sau 7-14 ngày quan sát sự sinh trƣởng và so sánh với môi trƣờng có nguồn cacbon là D-Glucose (đối chứng dƣơng) và không có nguồn cacbon (đối chứng âm) [26].
- Khả năng sử dụng nguồn nitơ: Xạ khuẩn đƣợc nuôi ở nhiệt độ 28-30oC trên môi trƣờng ISP8 có bổ sung các nguồn nitơ (1,0%, w/v): L-Histidine monohydrat, L- Phenylalanin, L-Arginin, L-Lysin, L-Threonin, L-Cystein...
Sau 7-14 ngày quan sát sự sinh trƣởng, so sánh với ống đối chứng âm (môi trƣờng ISP9) và đối chứng dƣơng (môi trƣờng có L-Asparagin monohydrat).
- Xác định nhiệt độ, pH nuôi cấy thích hợp: Chủng MPT28 đƣợc nuôi trên môi trƣờng thạch Bennett ở các nhiệt độ khác nhau (15o
C; 30oC; 37oC; 45oC) và pH 3,0-12,0. Sau 5-7 ngày nuôi cấy, quan sát sự sinh trƣởng của xạ khuẩn.
- Xác định nồng độ NaCl thích hợp: chủng MPT28 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Bennett thạch có bổ sung NaCl với nồng độ tăng dần từ 1,0-10,0% (w/v) ở 30o
C, sau 5-7 ngày nuôi cấy, quan sát sự sinh trƣởng của xạ khuẩn.
2.2.6. Phân loại chủng xạ khuẩn MPT28 dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA 16S rDNA
Trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F và 1429R có trình tự nhƣ trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA
Tên đoạn mồi Trình tự mồi
27F 5‟-TAACACATGCAAGTCGAACG-3‟
1429R 5‟-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3‟
Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%. Kích thƣớc của các đoạn DNA thu đƣợc sau phản ứng PCR đƣợc so sánh với thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ). Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM
– DNA Purification (Invitrogen, Mỹ) và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, Mỹ) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trình tự gen 16S rDNA đƣợc so sánh với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank (NCBI) nhờ công cụ BLAST.
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả nghiên cứu đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê sinh học trên phần mềm excel. Phần mềm sử dụng các hàm tính toán dựa trên những công thức cơ bản của thống kê trong đó có công thức:
Giá trị trung bình ( ): Độ lệch chuẩn ( ): Sai số m:
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại tỉnh Phú Thọ
Quan sát các mẫu phân lập từ 6-8 tuần cho thấy, các chủng xạ khuẩn phát triển khá chậm trên 8 loại môi trƣờng thạch, số lƣợng xạ khuẩn đa dạng, đạt từ 2-3 chủng/mẫu. Từ các bộ phận khác nhau của cây Màng tang (rễ, thân, lá) đã phân lập đƣợc 25 chủng xạ khuẩn nội sinh có màu sắc hệ khuẩn ty đa dạng. Trong một số nghiên cứu trƣớc đây, nhƣ của Gangwar và cộng sự (2011) đã phân lập đƣợc 40 chủng xạ khuẩn nội sinh từ các mẫu rễ, thân, lá trên cây lô hội (Aloe vera), bạc hà (Metha sp.) và hƣơng nhu tía (Ocimum santum) [25], [37]. Năm 2012, với 4 mẫu cây thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.) thu thập tại Xishuangbanna, tỉnh Vân Nam, Trung Quốc, nhóm nghiên cứu của Li tại Viện vi sinh vật học Vân Nam đã phân lập đƣợc 228 chủng xạ khuẩn nội sinh [37]. So sánh với hai nghiên cứu trên thì số lƣợng xạ khuẩn nội sinh phân lập đƣợc trên cây Màng tang trong nghiên cứu chƣa cao. Số lƣợng xạ khuẩn chƣa cao có thể do trong cây Màng tang có tinh dầu thể hiện hoạt tính ức chế phát triển đối với nhiều loại vi sinh vật [44].
Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập trên một số môi trƣờng đặc hiệu sau 6 tuần nuôi cấy
Các chủng xạ khuẩn sau khi phân lập và cấy thuần khiết, đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thạch YIM38 để quan sát các đặc điểm hình thái, màu sắc
khuẩn lạc, sắc tố sinh ra trong môi trƣờng và để phân nhóm xạ khuẩn theo màu sắc khuẩn lạc (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình phân lập từ mẫu cây Màng tang
STT Ký hiệu chủng Môi trƣờng Bộ phận Đặc điểm khuẩn lạc Hình ảnh khuẩn lạc 1 MPT14 CA Lá Khuẩn lạc nhỏ, tròn không đều, mép răng cƣa, khô, màu trắng, sinh sắc tố.
2 MPT37 ISP5 Thân Khuẩn lạc to, lồi, khô, không đều, tạo nhú ở trung tâm, màu trắng, sinh sắc tố.
3 MPT21 SPA Lá Khuẩn lạc không đều, màu xám, khô, lồi, răng cƣa, có vòng vết nứt ở tâm, không sinh sắc tố.
4 MPT26 SA Rễ Khuẩn lạc tròn, không đều, khô, vòng tròn đồng tâm, màu vàng , sinh sắc tố
5 MPT28 SA Rễ Khuẩn lạc khô, lồi, không đều, tạo nhú ở trung tâm, màu xám, phát phóng xạ, dang phấn, không sinh sắc tố
3.2. Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang
3.2.1. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo bộ phận của cây Màng tang
Trên cơ sở 25 chủng xạ khuẩn nội sinh đã thu nhận đƣợc, tiến hành phân tích, đánh giá mức độ đa dạng sinh học theo tỉ lệ xạ khuẩn trên bộ phận cây Màng tang (Hình 3.2).
Hình 3.2. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân bố trên các bộ phận của cây Màng tang
Kết quả hình 3.2 cho thấy, xạ khuẩn có mặt ở tất cả các bộ phận của cây, trong đó số chủng xạ khuẩn phân lập từ rễ là cao nhất (đạt 40%); tiếp theo là thân (32%) và thấp nhất là lá (28%). Kết quả trên có chút khác biệt so với nghiên cứu của Zhao và cộng sự đã phân lập đƣợc 560 chủng xạ khuẩn từ 26 cây dƣợc liệu khác nhau tại vùng cao nguyên Panxi, Trung Quốc. Tỷ lệ phân lập các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh cao nhất ở rễ (58,2%), thân (27,8%) và lá (14,0%) [73]. Tƣơng tự, nhóm nghiên cứu của Madhuarama (2014) đã công bố công trình nghiên cứu đánh giá đa dạng và tiềm năng của xạ khuẩn nội sinh trong ba cây dƣợc liệu (cây lô hội, bạc hà, hƣơng nhu tía) ở
Ấn Độ, trong đó tỷ lệ xạ khuẩn phân lập từ rễ, thân, lá đạt lần lƣợt: 70,0%; 17,5% ; 12,5% [41]. Đa số các nghiên cứu trên thế giới đã nhận định rằng xạ khuẩn phân lập từ mẫu lá luôn thấp hơn so với rễ và thân và mật độ xạ khuẩn phần lớn phụ thuộc vào đặc điểm sinh học của cây.
3.2.2. Đa dạng xạ khuẩn trên cây Màng tang theo môi trường phân lập
Theo các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh, phƣơng pháp xử lý mẫu và thành phần môi trƣờng là yếu tố chính quyết định đến kết quả phân lập, đánh giá sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh và tìm ra các loài xạ khuẩn mới [47]. Kết quả đánh giá đa dạng các chủng xạ khuẩn phân lập dựa trên 8 loại môi trƣờng đặc hiệu đƣợc thể hiện trên hình 3.3.
0 1 2 3 4 5
TWYE HV TA SPA STA SA CA ISP5 2 5 4 3 4 2 3 2
Môi trường phân lập
Hình 3.3. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang đƣợc phân lập trên các loại môi trƣờng khác nhau
Kết quả cho thấy, tỷ lệ xạ khuẩn phân lập cao nhất trên môi trƣờng HV, SPA, SA ( 4-5 chủng) đạt từ 16% đến 20 % tổng số chủng xạ khuẩn, tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân lập trên các môi trƣờng nhƣ TWYE, CA, ISP5 thấp (2 chủng), dƣới 10% (Hình 3.3). Trên đối tƣợng cây sồi (Callitris preissii), cây bạch đàn đỏ (Eucalyptus camaldulensis), cây bạch đàn trắng (Eucalyptus microcarpa), cây son (Pittosporum phylliraeoides), Onuma và cộng sự đã phân lập 574 chủng xạ khuẩn từ 10 loại môi trƣờng có tỷ lệ phân lập xạ khuẩn lần lƣợt: MMY (5,5%), YECG (5,9%), HVA (9,4%), Xyl (10,1%), CMC (14,4%), GGXA (11,8%), Pec (8,5%), GGAG (11,8%), AA (11,6%), HVG (11,0%). Kết quả phân tích trình tự gen 16s rDNA định danh 17 chi khác
nhau, trong đó chi Streptomyces chiếm tỷ lệ cao nhất (71,7%), tiếp đó là các chị xạ khuẩn hiếm nhƣ: Promicromonospora (8,9%), Pseudonocardia (6,3%),
Kribbella (4,3%), Nocardioides (1,9%), Nocardia (1,7%), Amycolatopsis
(1,0%), Micromonospora (1,0%), Actinomycetospora (1,0%),
Actinopolymorpha (0,4%), Actinomadura (0,3%), Polymorphospora (0,3%),
Williamsia (0,3%), Gordonia (0,2%), Nocardiopsis (0,2%), Nonomuraea
(0,2%) Flindersiella (0,2%) [48].
Cũng tƣơng tự nghiên cứu trên, Li và cộng sự (2012) đã phân loại 228 chủng xạ khuẩn thuộc 19 chi nhƣ: Promicromonospora (11,4%),
Pseudonocardia (6,6%), Nocardia (4,8%), Nonomuraea (4,4%), Rhodococcus
(3,5%), Kribbella (3,1%), Micromonospora (3,1%), Actinomadura (2,6%),
Streptosporangium (1,3%), Amycolatopsis (1,3%), Dactylosporangium
(0,9%), Blastococcus (0,4%), Glycomyces (0,4%), Kocuria (0,4%),
Micrococcus (0,4%), Gordonia (0,4%), Microbispora (0,4%),
Phytomonospora (0,4%) và Streptomyces chiếm 53,9% trên sáu loại môi trƣờng đặc hiệu [37].
Nhìn chung, tỷ lệ phân lập xạ khuẩn nội sinh thuộc chi Streptomyces
luôn chiếm tỷ lệ cao (>50%) nên các nhóm nghiên cứu trên thế giới luôn ƣu tiên sử dụng các phƣơng pháp, lựa chọn các loại môi trƣờng đặc hiệu nhằm phân lập các chủng xạ khuẩn hiếm không thuộc chi Streptomyces.
3.2.3. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo nhóm màu khuẩn ty
Sự khác biệt về màu sắc hệ khuẩn ty xạ khuẩn đƣợc hình thành do nhiều nguyên nhân khác nhau nhƣ: khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm, chất dinh dƣỡng, pH... Chính vì vậy, mầu sắc khuẩn ty đƣợc coi là tiêu chí cơ bản để chọn lọc các chủng xạ khuẩn trên môi trƣờng phân lập, tránh chọn lọc các chủng có cùng đặc điểm hình thái, màu sắc giống nhau… Kết quả phân nhóm xạ khuẩn nội sinh phân lập đƣợc trên các mẫu Màng tang trong nghiên cứu đƣợc thể hiện trên hình 3.4.
0 2 4 6 8 10 Trắng Vàng Xám Xanh Đỏ Nâu Tím 10 10 3 2 0 0 0 Nhóm màu
Hình 3.4. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn nội sinh đƣợc phân theo nhóm màu Trên cơ sở 25 chủng xạ khuẩn đã đƣợc phân lập và thuần khiết, các chủng có màu sắc hệ khuẩn ty thuộc 4/7 nhóm màu xuất hiện với tỷ lệ khác nhau (Hình 4). Theo đó, xạ khuẩn thuộc nhóm màu vàng là 10 chủng đạt (40%), và trắng là 10 chủng đạt (40%) chiếm ƣu thế, tiếp theo xám là 3 chủng đạt (12%), và thấp nhất là xanh 2 chủng đạt (8%) và không phát hiện xạ khuẩn thuộc nhóm màu đỏ, nâu hay tím. Kết quả trên cũng gần giống với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khi phân lập xạ khuẩn từ đất và biển cũng nhận thấy nhóm màu trắng thƣờng chiếm tỷ lệ cao hơn [4], [20].
Tuy nhiên, màu sắc của khuẩn ty khí sinh hay khuẩn ty cơ chất là đặc điểm dễ thay đổi, phụ thuộc vào thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng, tuổi của chủng và các điều kiện vật lý. Kết quả phân lập và đánh giá đa dạng của xạ khuẩn nội sinh chứng tỏ Màng tang là cây chủ có nhiều loài xạ khuẩn nội sinh tồn tại và phát triển và kết quả cũng chỉ ra đây là những khảo sát đầu tiên về xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại Việt Nam.
3.3. Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh
3.3.1. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn
Theo các nghiên cứu công bố trên thế giới, xạ khuẩn nội sinh phân lập từ các cây dƣợc liệu (đặc biệt là loại chứa tinh dầu hoặc chất kháng vi sinh vật) có tỷ lệ kháng vi sinh vật cao. Ngoài ra, các chủng xạ khuẩn này có khả năng kháng các chất kháng sinh, chất ức chế vi sinh vật nội tại trong các cây
dƣợc liệu [23]. Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 25 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây Màng tang đƣợc tổng hợp trong bảng 3.2 và bảng 3.3.