CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. Đặc điểm sinh học vàphân loại của chủng xạ khuẩn MPT28
3.4.1. Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT28
3.4.1.1. Đặc điểm hình thái và bề mặt chuỗi bào tử
Xạ khuẩn đƣợc phân thành 7 nhóm theo màu sắc khuẩn ty khí sinh gồm: trắng, vàng, đỏ, tím, xám, xanh, xanh da trời... Màu sắc của KTKS, KTCC và đặc điểm chuỗi bào tử đƣợc sử dụng tiêu chuẩn cơ bản để nghiên cứu đặc điểm của xạ khuẩn MPT28 (Bảng 3.6; Hình 3.8).
Bảng 3.6. Màu sắc khuẩn lạc của chủng MPT28 khi nuôi cấy trên các môi trƣờng khác nhau Môi trƣờng Khuẩn ty Sắc tố KTKS KTCC Sắc tố tan Melanin ISP1 Xám 2 fe Vàng 1 fb - - ISP2 Xám 2 fe Vàng 1 fb - - ISP3 Xám dc Vàng 1 db - - ISP4 Xám dc Vàng 1 ba - - ISP5 Xám 5 ih Vàng 1 ba - - ISP6 Xám 5 ih Vàng 1 db - - ISP7 Vàng 1 cb Vàng 2 db - -
A B
Hình 3. 8. Hình thái khuẩn lạc (A) trên môi trƣờng ISP1 và bề mặt chuỗi bào tử (B) dƣới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 7.500 lần của chủng
MPT28
Kết quả ở bảng 3.6 và hình 3.8 cho thấy chủng MPT28 thuộc nhóm xạ khuẩn màu xám, không sinh melanin và sắc tố tan, chuỗi gồm 12-20 bào tử, cấu trúc cuống sinh bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử hình trụ, gai (sp).
3.4.1.2. Đặc điểm sinh hóa
Việc nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn carbon, nitơ nhằm đánh giá đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn, bên cạnh đó giúp định hƣớng tìm nguồn dinh dƣỡng thích hợp cho quá trình lên men. Kết quả nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn carbon, nitơ của chủng xạ khuẩn MPT28 trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Khả năng đồng hóa nguồn carbon, nitơ của chủng xạ khuẩn MPT28 sau 7-14 ngày nuôi cấy ở 30°C
Nguồn carbon (1,0%, w/v) Khả năng sinh trƣởng Nguồn nitơ (1,0%, w/v) Khả năng sinh trƣởng
D-Glucose + L-Asparagin monohydrat +
D-Glactose + L-Histidine monohydrat -
D-Mantose + L- Phenylalanin +
α-Lactose + L-Leucin +
D-Glucosamine - L-Arginine + Myo-Inositol + L-Isoleucin + D-Manitol + L-Valine + D-Fructose + L-Methionin + L-Rhamnose + L-Lysin - D-Saccharnose + L-Threonine + D-Sorbitol + L-Cystein + D-Trehalose + 2 amino 2 hydroxy- methyl 1,3 promo -
Đối chứng âm - Đối chứng âm -
Ghi chú :(+) Sinh trưởng tốt; (-) Không sinh trưởng
Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh hóa cho thấy, chủng MPT28 có khả năng đồng hóa đƣợc nhiều nguồn carbon nhƣ D-Glucose, D-Glactose, Myo- Inositol, D-Manitol, D-Fructose, D-Saccharnose, D-Sorbitol... và nitơ nhƣ L- Leucin, L-Arginine, L-Valine, L-Threonine... (Bảng 3.7).
3.4.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối, pH, nhiệt độ tới khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn
Nhiệt độ, pH, nồng độ muối là đặc điểm có ý nghĩa quan trọng đối với việc ứng dụng xạ khuẩn trong lên men thu nhận các hợp chất có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thƣ. Sinh trƣởng của chủng MPT28 trong môi trƣờng Bennett ở các điều kiện thí nghiệm thay đổi về nồng độ muối, pH và nhiệt độ đƣợc thể hiện trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trƣởng của chủng MPT28
Điều kiện Dải sinh trƣởng
Nhiệt độ (o
C) 30-37
Nồng độ muối (%) 0-3
pH ban đầu 6-11
Kết quả bảng 3.8 cho thấy chủng xạ khuẩn trong nghiên cứu thuộc nhóm ƣa ấm; sinh trƣởng tốt ở dải nhiệt từ 30-37 o
độ muối ≥ 3,0%, chủng MPT28 sinh trƣởng yếu hoặc không sinh trƣởng. Kết quả trên cũng phù hợp với tính chất và điều kiện khí hậu của mẫu thu thập tại tỉnh Phú Thọ.
3.4.2. Phân loại dựa trên xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA của chủng xạ khuẩn MPT28 chủng xạ khuẩn MPT28
3.4.2.1. Khuếch đại gen 16S rDNA
Kết quả DNA tổng số của chủng xạ khuẩn MPT28 (Phụ lục 2) đƣợc sử dụng làm vật liệu di truyền cho nghiên cứu khuếch đại gen 16S rDNA, kết quả thể hiện ở hình 3.9.
Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA trên gel agarose 1,0%
Băng M: Thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ); Băng 1: Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA của chủng MPT28.
Kết quả khuếch đại gen 16S rDNA của chủng MPT28 cho thấy, sản phẩm DNA của phản ứng PCR cho một băng rõ nét và duy nhất có kích thƣớc khoảng 1400 bp (Hình 3.9). Nhƣ vậy, sản phẩm của PCR thu đƣợc trong thí nghiệm là đặc hiệu, đáp ứng yêu cầu cho tinh sạch và giải trình tự gen 16S rDNA.
3.4.2.2. Giải trình tự đoạn gen 16S rDNA
Kết quả phân tích trình tự gen 16S rDNA của chủng xạ khuẩn đƣợc trình bày trong bảng 3.9.
Bảng 3.9. Trình tự gen mã hóa 16S rDNA của chủng MPT28
Trình tự gen 16S rDNA của chủng MPT28 sau khi blast trên NCBI
Mã số truy cập trên GenBank
Độ tƣơng đồng (%)
Streptomyces albogriseolus 71.1 KX454152.1 97%
Streptomyces albogriseolus T8 KU324449.1 97%
Streptomyces griseorubens AU2 KX156364.1 97%
Streptomyces sp. DB21 KX443347.1 97%
Streptomyces sp. NCD21 KU382328.1 97%
Kết quả phân tích trình tự gen 16S rDNA và so sánh với các trình tự gen đã công bố trên GenBank bằng công cụ BLAST (NCBI) cho thấy gen mã hóa 16S rDNA của chủng MPT28 có độ tƣơng đồng chƣa cao so với gen tƣơng ứng của chủng Streptomyces albogriseolus 71.1 (Bảng 3.9). Dựa vào kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh lý – sinh hóa và phân tích trình tự gen 16S rDNA, chủng xạ khuẩn MPT28 đƣợc định danh là Streptomyces albogriseolus MPT28.
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận 4.1. Kết luận
1. Từ 03 mẫu (rễ, thân, lá) cây Màng tang tại tỉnh Phú Thọ, đã phân lập đƣợc 25 chủng xạ khuẩn nội sinh. Đánh giá đa dạng xạ khuẩn dựa trên tỷ lệ phân lập từ các bộ phận cây (rễ, 40%; thân, 32%; lá, 28%); môi trƣờng phân lập (cao nhất trên môi trƣờng HV, SPA đạt từ 16% đến 20 %); nhóm màu của xạ khuẩn (nhóm màu vàng, trắng (10 chủng, 40%) chiếm ƣu thế).
2. Sàng lọc đƣợc 14 chủng xạ khuẩn có khả năng kháng ít nhất một loại VSV kiểm định, trong đó 8 chủng mang gen pks-I (chiếm 57,1%), 11 chủng mang gen pks-II, nrps (chiếm 78,6%), 8 chủng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline.
3. Chủng MPT28 có khả năng sinh kháng sinh phổ rộng, hoạt tính cao. Dựa trên phân tích đặc điểm sinh học và trình tự gen 16S rDNA, chủng MPT28 đƣợc định danh là Streptomyces albogriseolus MPT28.
4.2. Kiến nghị
1. Tách dòng và xác định trình tự gen PKS-II, NRPS của chủng S. albogriseolus MPT28.
2. Nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm hệ gen và khả năng ứng dụng của chủng S.albogriseolus MPT28.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Lân Dũng, Đào Xuân Mƣợu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972). Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB Khoa học và Kĩ Thuật, Hà Nội.
2. Egorov NX (1976), Thực tập vi sinh vật học. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
3. Lê Mai Hƣơng, Trần Thị Nhƣ Hằng, Trần Huy Thái, Dƣơng Đức Huyến (2005), “Phân lập, sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của các chủng nấm nội ký sinh thực vật phân lập từ một số vƣờn thuốc phía Bắc Việt Nam”, Tạp chí Hóa Học, tr. 352, 20-23.
4. Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở Việt Nam, Hà Nội.
5. Hoàng Hoa Long, Dorothea M, Ian TB (2013), “Vi khuẩn nội sinh
Bacillus sp. B55 phân lập từ Nicotiana attenuata kích thích sinh trƣởng và tăng khả năng thích nghi của cây chủ trong điều kiện tự nhiên”, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc2013, 2, tr. 329-333.
6. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội.
7. Văn Thị Phƣơng Nhƣ, Cao Ngọc Điệp (2013), “Phân lập và đặc tính vi khuẩn nội sinh cây lúa (Oryza sativa L.) trồng trên đất của tỉnh Phú Yên, Việt Nam”, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc, 2 tr.450 – 454.
8. Quách Ngọc Tùng, Khiếu Thị Nhàn, Chu Kì Sơn, Vũ Thị Hạnh Nguyên, Vũ Thu Trang, Phí Quyết Tiến (2014), “Đánh giá và sàng lọc xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế có khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 12(2), tr.1 – 7.
Tiếng Anh
9. Adhikari A, Basnyat R (1999), “Phenotypic characteristics of Xanthomonas campestris pv. campestris from Nepal”, EJPP, 105(3), pp.303 - 305.
10.Araujo WL, Marcon J, WJr M, Van Elsas JD, JWVan V, Azevedo JL (2002), “Diversity of endophytic bacterial populations and their interaction with Xylella fastidiosa in citrus plants”, Appl. Environ. Microbiol., 68, pp.4906 – 4914.
11.Bacon CW, White JF (2000), Microbial endophytes, New York, Marcel Dekker.
12.Berdy J (2005),“Bioactive microbial metabolites”, J. Antibiot., 58, pp.1 – 26.
13.Cao LX, Qiu ZQ, You JL, Tan HM, Zhou S (2005), “Isolation and characterization of endophytic Streptomycete antagonists of fusarium wilt pathogen from surface-sterilized banana roots”, FEMS Microbiol. Lett., 247, pp.147-152.
14.Castillo U, Harper JK, Strobel GA, Sears J, Alesi K, Ford E, Lin J, Hunter M, Maranta M, Ge H, Yaver D, Jensen JB, Porter H, Robison R, Miller D, Hess WM, Condron M, Teplow D (2003), “Kakadumycins, novel antibiotics from Streptomyces sp. NRRL 30566, an endophyte of
Grevillea pteridifolia”, FEMS Microbiol. Lett., 234, pp.183–190.
15.Chen HH, Qin S, Lee JC, Kim CJ, Xu LH, Jiang CL, Li WJ (2009a), “Streptomyces mayteni sp. nov., a novel endophytic actinomycete isolated from Chinese medicinal plant”, Antonie Leeuwenhoek, 95, pp.47–53.
16.Compant S, Duffy B, Nowak J, Clément C, Barka EA (2005), “Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects”, Appl. Environ. Microbiol., 71, pp.4951–4959.
17.Conn VM, Walker AR, Franco CMM (2008), “Endophytic actinobacteria induce defense pathways in Arabidopsis thaliana”, Mol. Plant. Microbe. Interact., 21, pp.208–218.
18.Coombs JT, Michelsen PP, Franco CMM (2004), “Evaluation of endophytic actinobacteria as antagonists of Gaeumannomyces graminis var. tritici in wheat”, Biol. Control., 29, pp.359–366.
19.Coppen JJW (1995), Non-Wood Forest Products 1: Flavours and Fragrances of Plant Origin, Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome.
20.Davis KE, Joseph SJ, Janssen PH (2005), “Effects of growth medium, inoculum size, and incubation time on culturability and isolation of soil bacteria”, Appl. Environ.Microbiol., 71, pp.826–834.
21.Denmain A, Davies J (1999), Manual of industrial microbiology and biotechnology, ASM, Washington DC.
22.El-Bondkly AM, El-Gendy MM (2010), “Keratinolytic activity from new recombinant fusant AYA2000, derived from endophytic
Micromonospora strains”, Can J. Microbiol., 56, pp.748 – 760.
23.El-Tarabily KA (2003), “An endophytic chitinase-producing isolate of
Actinoplanes missouriensis, with potential for biological control of root rot of lupine caused by Plectosporium tabacinum”, Aust. J. Bot., 51, pp.257–266.
24.El-Tarabily KA, Sivasithamparam K (2006), “Non-streptomycete actinomycetes as biocontrol agents of soil-borne fungal plant pathogens and as plant growth promoters”, Soil. Biol. Biochem., 38, pp.1505– 1520.
25.Gangwar M, Dogra S and Sharma N (2011), “Antagonistic bioactivity of endophytic actinomycetes isolated from medicinal plants”, JALRP,
2(4), pp.154-157.
26.Garrity GM, Holt JG (2001), The road map to the manual. In Bergey’s manual of systematic bacteriology, Springer, pp.119-166.
27.Giorgio M, Pierantonio M, Emanuela S, Gaetano C, Luca G (2004), “Anthracyclines: Molecular Advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity”, Pharmacol. Rew., 56, pp.185 – 229.
28.Gontang EA, Gaudencio SP, Fenical W, Jense PR (2010), “Sequence- based analysis of secondary-metabolite biosynthesis in marine actinobacteria”, Appl. Environ. Microbiol, 76(8), pp.2487 – 2499.
29.Gonzalez I, Ayuso-Sacido A, Anderson A, Genilloud O (2005), “Actinomycetes isolated from lichens: evaluation of their diversity and detection of biosynthetic gene sequences”, FEMS Microbiol. Ecol., 54, pp.401 – 415.
30.Hasegawa S, Meguro A, Shimizu M, Nishimura T, Kunoh H (2006), “Endophytic actinomycetes and their interactions with host plants”,
Actinomycetologica, 20, pp.72–81.
31.Ho C, Jie-Pinge O, Liu Y, Hung C, Tsai M, Liao P, Wang E, Chen Y, Su Y (2010), “Compositions and in vitro anticancer activities of the leaf and fruit oils of Litsea cubeba from Taiwan”, Nat. Prod. Commun., 5, pp.617–620
32.Igarashi Y (2004), “Screening of novel bioactive compounds from plant-associated actinomycetes”, Actinomycetologica, 18, pp.63–66. 33.Khieu Thi Nhan (2015). Exploring diversity and antimicrobial,
antitumor activities of culturable endophytic actinomycetes associated with Dracaena cochinchinensis Lour, China.
34.Kizuka M, Enokita R, Takanashi K, Okamoto Y, Otsuka T, Shigematsu Y, Inoue Y, Okazaki T (1998), “Studies on actinomycetes isolated from plant leaves”, Actinomycetologica, 12, pp.89–91.
35.Küster E, Williams ST (1964), “Media for the isolation of
Streptomycetes: starch casein medium”, Nature, 202, pp.928–929. 36.Li J, Zhao GZ, Chen HH, Wang HB, Qin S, Zhu WY, Xu LH, Jiang
endophytic Streptomycetes from pharmaceutical plants in rainforest”,
Lett Appl Microbiol, 47, pp.574 – 580.
37.Li J, Zhao GZ, Huang HY, Qin S, Zhu WY, Zhao LX, Xu LH, Zhang S, Li WJ, Strobel G (2012), “Isolation and characterization of culturable endophytic actinobacteria associated with Artemisia annua
L. Antonie van Leeuwenhoek, 101, pp.515-527.
38.Li WR, Shi QS, Liang Q, Xie XB, Huang XM, Chen YB (2014), “Antibacterial activity and kinetics of Litsea cubeba oil on Escherichia coli”, PLOS one, 9(11), pp.1 – 6.
39.Loria R, Bukhalid RA, Fry BA, King RR (1997), “Plant pathogenecity in the genus Streptomyces”, Plant.Dis., 81, pp.836 – 846.
40.Lu CH, Shen YM (2004), “Two new macrolides produced by
Streptomyces sp. CS”, J. Antibiot., 57, pp.597–600.
41.Madhurama G, Sonam D, Urmil PG, Ravindra NK (2014), “Diversity and biopotential of endophytic actinomycetes from three medicinal plants in India”, Afr. J. Microbiol. Res., 8(2), pp.184 – 191.
42.Mahera MS, Sulaiman AA, Ismet A, Milton W (2013), “Evaluation of antibiotic producing genes in Streptomyces isolated from a desert environment of Saudi Arabia”, Life Sci. J., 10(4), pp.974 – 980.
43.Merzaeva và Shirokikh (2010), “The production of auxins by the endophytic bacteria of Winter Rye”, Appl. Biochem. and Microbiol., 3, pp.44 - 50.
44.Nguyen Hai Van, Vu Thi Hanh Nguyen, Vu Thu Trang, Phi Quyet Tien, Khieu Thi Nhan, Samira Sarter, Chu Ky Son (2016), “Antimicrobial activities and interaction effects of vietnamese Litsea cubeba (Lour.) Pers essential oil and its endophytic actinobacteria”,
Journal of Science and Technology, 54(4A), pp.234 – 241.
45.Noosidum N, Prabaripai A, Charoenviriyaphap T, Chandrapatya A (2008), “Excito-repellency properties of essential oils from Melaleuca leucadendron L., Litsea cubeba (Lour.) Persoon, and Litsea salicifolia
(Nees) on Aedes aegypti (L.) mosquitoes”, J. Vector. Ecol., 33, pp.305–312.
46.Nor Azah MA, Susiarti S (1999), Litsea cubeba (Lour.) Persoon. In Plant Resources of South-East Asia, Backhuys Publishers, Leiden, pp 47.Okazaki T (2003), Studies on actinomycetes isolated from plant leave,
Queensland Complete Printing Service, Nambour.
48.Onuma Kaewkla, Christopher MMF (2013), “Rational approaches to improving the isolation of endophytic actinobacteria from Australian native trees”, Microb. Ecol., 65, pp.384-393.
49.Priham TG and Tenser HD (1974), “Streptomyces. Waksman and first and second studies”, Int. J. Syst. Bacteriol., 18, pp.279.
50.Pullen C, Schmitz P, Meurer K, Bamberg DD, Lohmann S, Franc SDC, Groth I, Schlegel B, Möllmann U, Gollmick F, Gräfe U, Leistner E (2002), “New and bioactive compounds from Streptomyces strains residing in the wood of Celastraceae”, Planta, 216, pp.162–167.
51.Qin S, Xing K, Jiang JH, Xu LH, Li WJ (2011), “Biodiversity, bioactive natural products and biotechnological potential of plant- associated endophytic actinobacteria”, Appl. Microbiol. Biotechnol., 89, pp.457 – 473.
52.Qin S, Zhao GZ, Klenk HP, Li J, Xu LH, Li WJ (2009d), “Nonomuraea antimicrobica sp. nov., an endophytic actinomycete isolated from leaves of Maytenus austroyunnanensis”, Int. J. Syst. Evol. Microbiol.,
59, pp.2453–2457.
53.Quadt-Hallmann A, Benhamou N, Kloepper JW (1997), “Bacterial endophytes in cotton: mechanisms of entering the plant”, Can. J. Microbiol., 43, pp.577-582.
54.Rojas DJ, Sette LD, Araujo WL, Lopes MSG, Silva LF, Furlan RLA, Padilla G (2012), “The diversity of polyketide synthase genes from sugarcane-derived fungi”, Microb. Ecol., 63, pp.565 – 577.
55.Sacido-Ayuso A and Genilloud O (2004), “New PCR primer for the screening of NRPS and PKS-I systems in actinomycetes: Detection and distribution of these biosynthetic gene sequence in major taxonomic groups”, Microbial Ecology, 38, pp.10 – 14.
56.Sambrook J, Russell DW (2001), Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NewYork.
57.Shimizu M, Suzuki T, Mogami O, Kunoh H (2005), “Disease resistance of plants induced by endophytic actinomycetes. In: Tsuyumu S, Leach JE, Shiraishi T, Wolpert T (eds) Genomic and genetic analysis of plant parasitism and defense”, APS, St. Paul, (3), pp.292–293.
58.Shirling EG and Gottlieb D (1966), “Methods for characterization of
Streptomyces species”, Int. J. Syst. Bacteriol., 16, pp.313 – 340.
59.Smith GE (1957), “Inhibition of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici
by a species of Micromonospora isolated from tomato”,
Phytopathology, 47, pp.429–432.
60.Sri P, Yulin L, Antonius Su, Sri B, Latifah KD (2012), “Alpha- glucosidase inhibitor activity and characterization of endophytic actinomycetes isolated from some Indonesian diabetic medicinal, plants”, IJPSR, 4(1), pp.327 – 334.
61.Strobel G, Daisy B (2003), “Endophytes as sources of bioactive products”, Microbes. Infect., 5, pp.535–544.
62.Strobel G, Daisy B, Castillo U, Harper J (2004),” Natural products from endophytic microorganisms”, J. Nat. Prod., 67, pp.257–268.