Phổ 1H-NMR của chất 1 cho 2 tín hiệu singlet của 2 nhóm methyl liên kết với nguyên tử cacbon bậc 4 tại δH 0.89, 1.05 (s, 3H) tương ứng với các nhóm methyl tại C-18 và C-19; 01 tín hiệu cộng hưởng của nhóm methyl dạng singlet tại δH 2.27 ppm (s, 3H, C-21) tương ứng với nhóm methyl liên kết với nguyên tử Csp2 trong keton, đây là tín hiệu đặc trưng của khung pregnane dạng ketone; 02 tín hiệu cộng hưởng của các proton của 2 nhóm methyl dạng doublet tại liên kết với nhóm methin (CH) tại δH 1.39 (d, J = 6.2 Hz, 3H) và 1.27 (d, J = 7.0 Hz, 3H).
Trên phổ 1H-NMR của chất 1 còn xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của các phân tử đường, điển hình như: δH 4.81 (d, J = 8.2 Hz, 1H) và 4.60 (d, J = 9.5 Hz, 1H) là 2 nguyên tử proton ở nguyên tử cacbon C1’ và C1’’ dạng cấu hình β – do có hằng số tách spin-spin J < 10 Hz [14-16]. Các nguyên tử proton khác của các phân tử đường cộng hưởng trong khoảng từ 3.0 – 4.0 ppm.
Bảng 3.2: Giá trị độ chuyển dịch hóa học của chất1 (δ ppm, J Hz) Vị trí δC δH 1 38.06 1.53-1.54 (1H, m) 1.21-1.23 (1H, m) 2 28.93 1.83-1.85 (1H, m) 1.45-1.51 (1H, m) 3 72.83 3.41-3.45 (1H, m) 4 34.45 1.82- 1.85 (m, 2H) 5 44.50 2.23-2.35 (1H, m) 6 27.03 1.34-1.38 (1H, m) 1.47-1.51(1H, m) 7 32.50 1.63-1.68 (1H, m) 2.02-2.05 (1H, m) 8 65.96 9 53.25 2.32-2.34 (m, 1H) 10 39.17 11 76.77 5.04 (m, 1H) 12 30.96 2.35 (m, 1H), 13 46.01 14 71.28 15 27.86 1.53-1.57 (m, 1H) 1.68-1.71 (m, 1H) 16 25.36 1.57-1.62 (m. 1H) 2.05-2.10 (m, 1H) 17 63.90 2.94 (s, 1H) 18 10.30 0.89 (3H) 19 12.75 1.05 (3H) 20 213.37 21 30.37 2.27 (s, 3H)
1’ 99.18 4.81 (d, J = 8.2 Hz, 1H) 2’ 71.74 3.46 (m, 1H) 3’ 81.02 3.79 (m, 1H) 4’ 79.93 3.37 (m, 1H) 5’ 67.78 3.57 (m, 1H) 6’ 17.88 1.39 (d, J = 6.2 Hz, 3H) 7’ 61.94 3.68 (s, 3H, -OCH3) Ole 1’’ 96.88 4.60 (d, J = 9.5 Hz, 1H) 2’’ 36.07 1.42 (m), 1.95 (m) 3’’ 78.81 3.69 (m) 4’’ 79.15 3.21 (m, 1H) 5’’ 70.32 3.61 (m, 1H) 6’’ 18.58 1.27 (d, J = 7.0 Hz, 3H) 7’’ 55.64 3.37 (s, 3H, -OCH3) Hình 3.2. Phổ 13C-NMR của chất1
Phổ 13C-NMR của 1 cho thấy có các tín hiệu cộng hưởng của 36 nguyên tử cacbon. Trong đó có các tín hiệu cộng hưởng của mhóm methyl liên kết với các nguyên tử C bậc 4 tại δC là 10.30 (C-18) và 12.75 (C-19); giá trị độ chuyển dịch hóa học tại 30.37 ppm (C-21) là nguyên tử C trong nhóm methyl liên kết với Csp2 của nhóm ketone, nguyên tử cacbon cộng hưởng tại δC 213.37 ppm nguyên tử C của nhóm C=O dạng ketone. Nguyên tử cacbon C-3 cộng hưởng tại độ chuyển dịch hóa học là δC 72.83 ppm, nguyên tử C-11 cộng hưởng tại
δC là 76.77 ppm. Độ chuyển dịch Hóa học của hai nguyên tử cacbon của dị vòng 3 cạnh là C8 và C-14 là 65.96 và 71.28 ppm. So sánh các tín hiệu cộng hưởng của các nguyên tử cacbon trên với tài liệu tham khảo [14-16] nhận thầy đây là khung pregnane của nhóm steroid C-21, đây là khung đặc trưng của chi thực vật Marsdenia.
Hai tín hiệu cộng hưởng của hai nguyên tử cacbon C-1’ và C-1’’ của hai phân tử đường lần lượt là 99.18 và 96.88 ppm; các phân tử đường có nhóm methyl bậc 2 cộng hưởng tại 17.88 và 18.58 ppm. Để xác định chính xác loại được chúng tôi đã tiến hành thủy phân trong dung dịch HCl 1M trong 40 phút và đối chiếu với các phân tử đường chuẩn là 6-Deoxy-D-allopyranose (Allo) và D-olenadropyranose (Ole) nhận thấy đường có trong dung dịch thủy phân là hai đường trên bằng phương pháp TLC. Trên phổ 13C-NMR của chất 1 còn xuất hiện hai nhóm methyl liên kết với oxi với độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử C là 61.94 ppm và 55.64 ppm. Các tín hiệu cộng hưởng còn lại của các nguyên tử cacbon trong phân tử được tổng hợp trong bảng 3 dựa trên sự phân tích phổ 1H, 13C và HMBC.
Trên phổ HMBC của chất 1, nhân thấy phân tử β-D-olenadropyranose (Ole) liên kết với nguyên tử C-3 trên khung pregnane thông qua nguyên tử oxi và phân tử 6-Deoxy-D-allopyranose (Allo) liên kết với nguyên tử C-11 thông qua cầu nguyên tử oxi. Các nhóm methoxy được xác nhận trên phổ HMBC liên kết với
Hình 3.3. Sự tương quan giữa HC của chất 1 (HMBC)
Hình 3.4. Phổ MS của chất 1
Kết hợp với phổ khối lượng có peak ion m/z 691.4 [M+Na]+, kết hợp với phổ NMR nhận thấy chất 1 có công thức phân tử là C H O . Do đó, đối chiếu các dữ
liệu độ chuyển dịch hóa học trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13 C của chất 1 với các dữ liệu cộng hưởng từ hạt nhân trong các tài liệu tham khảo [14- 16] ta có thể kết luận chất 1 là 11-O-6’-deoxy-3’-O-methyl-β-D-allopyranosyl, 3-O-3’-O-methyl-β-D-olenadropyranosyl tenacigenin B.
:
Hình 3.5. Công thức cấu tạo của chất 1
3.2.2. Phân tích cấu trúc hợp chất 2
Cấu trúc hóa học của 2 được xác định dựa vào sự kết hợp phổ 1H-NMR,
13C-NMR, HSQC, HMBC, MS và tài liệu tham khảo để xác định được công thức cấu tạo của chất 2.
Phổ 1H-NMR của chất 2 cho một tín hiệu của triplet tại δH 0.89 ppm (t,
3H) là 3 proton của nhóm methyl liên kết với CH2. Một tín hiệu triplet tại δH
3.60 ppm (m, 2H) là methylene liên kết với nguyên tử oxy trong nhóm OH. Các tín hiệu proton khác của 2 cộng hưởng trong khoảng 1.0-1.8 ppm nhưng chồng lấn lên nhau, điều này có thể dự đoán trong phân tử chất 2 có nhiều nhóm
methylene (-CH2-) gần tương đương nhau trong cấu trúc của n-alcohol.
Hình 3.8. Phổ 13C-NMR của chất 2 (phổ giãn)
Trên phổ 13C-NMR của 2 cho ta thấy có các tín hiệu cộng hưởng của
nguyên tử Carbon của nhóm methyl là 13.09 ppm.
Nhóm CH2 liên kết với nguyên tử oxi trong nhóm OH cộng hưởng tại vị trí 62.10 ppm. Các nguyên tử carbon còn lại của các nhóm -CH2- trong chất 2 cộng hưởng tại các vị trí trong khoảng 21 ppm – 32 ppm.
Trên phổ HSQC và HMBC của chất 2 ta nhận thấy các tín hiệu tương tác trực tiếp và gián tiếp của các nguyên tử carbon và hydrogen.
Hình 3.9. Phổ HSQC của chất 2
Hình 3.10. Sự tương quan giữa HC của chất 2 (HMBC)
Trên phổ phổ HMBC của 2, ta có thể chỉ ra một số sự tương quan quan trọng giữa tín hiệu của methyl và hai nhóm -CH2- liền kề; proton của nhóm - CH2- liên kết với oxi (-O-CH2-) tương tác với carbon có δ = 24.7 và 31.8 ppm, do đó là hai nguyên tử carbon liền kề với nhóm -CH2- trong nhóm -O-CH2-.
Hình 3.11. Phổ MS của chất 2
Kết hợp với phổ khối lượng có peak ion m/z 691.7 [M+H]+ (100%), kết hợp với phổ NMR nhận thấy chất 2 có công thức phân tử là C48H98O. Dựa trên dữ liệu về phổ cộng hưởng từ hạt nhân, kết hợp tham khảo tài liệu tham khảo [18-19], có thể khẳng định chất 2 là n-alcohol, có công thức cấu tạo:
Hình 3.12. Công thức cấu tạo của chất 2
3.3. Kết quả nghiên cứu hoạt tính độc tế bào trên dòng tế bào ung thư
HeLa (cổ tử cung) và A549 (tế bào ung thư gan).
Như trình bày ở phần tổng quan, các ung thư cổ tử cung và ung thư gan là những loại khối u ác tính thường gặp nhất trên thế giới. Nhiều biện pháp được các nhà khoa học đưa ra để giảm tỉ lệ tử vong, chuẩn đoán sớm và xây dựng phác đồ điều trị tiên tiến, nghiên cứu tìm kiếm các loại thuốc mới, sử dụng các liệu pháp miễn dịch là hết sức quan trọng, trong đó các hợp chất thiên nhiên được quan tâm nghiên cứu [1-5].
Chi Marsdenia là một trong những loại chi thực vật giàu các hợp chất steroid C21, đây là nhóm hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học tốt đã được chỉ ra [4-27], trong đó quan trọng nhất là hoạt tính ức chế các dòng tế bào ung thư, điển hình như dòng tế bào ung thư gan A549. Khả năng tiêu diệt tế bào ung thư A549 của các chất có trong loài Marsdenia Tenacissima đã được chứng minh ảnh hưởng đến tế bào ở cấp độ phân tử [35-37]
Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành thử hoạt tính ức chế tế bào trên dòng tế bào ung thư HeLa (cổ tử cung) và tế bào ung thư gan (A549) của các hợp chất phân lập được từ loài Cỏ Bách Linh.
Bảng 3.3: Tác động gây độc tế bào ung thư của chất 1 Nồng Nồng
độ (µg/ml)
1 Ellipticine
Hela A549 Hela A549
100 71.21 76.29 99.64 84.05
20 47.04 30.13 76.73 79.91
4 9.46 17.29 51.31 45.36
0.8 -5.75 -6.49 25.43 23.85
IC50 32.94±2.48 41.62±5.49 0.37± 0.04 0.47± 0.03
Kết quả thử nghiệm do Viện công nghệ sinh học Việt Nam tiến hành cho thấy mẫu 1 thể hiện hoạt tính ức chế tốt sự phát triển của các dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 từ 32.94 - 41.62 µg/ml. Chất đối chứng dương Ellipticine hoạt động ổn định trong thí nghiệm.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Luận văn tốt nghiệp: “Xác định thành phần hóa học và đánh giá hoạt
tính của một số hợp chất hóa học từ loài Cỏ Bách Linh (Marsdenia longipes)”
thực hiện nhiệm vụ nghiên cứu phân lập các hợp chất từ loài Cỏ Bách linh. Luận văn đã hoàn thành các nhiệm vụ nghiên cứu và đạt được các kết quả chính sau:
1- Đánh giá định tích các nhóm hợp chất điển hình có trong cao chiết ethanol. 2- Đã phân lập được 2 hợp chất từ phần chiết cao ethyl acetate bằng các phương pháp sắc ký. Sử dụng các phương pháp phổ hiện đại 1H-NMR, 13C-NMR, phổ 2 chiều và phổ MS đã xác định được cấu trúc của 2 chất đã phân lập được từ loài Cỏ Bách Linh.
3- Xác định hoạt tính ức chế tế bào ung thư HeLa và A549 của một hợp chất phân lập được. Kết quả cho thấy chất 1 thể hiện hoạt tính ức chế tốt dòng tế bào ung thư.
2. Kiến nghị
Để cung cấp thêm thông tin khoa học có giá trị về loài cỏ Bách linh, sau quá trình thực hiện luận văn, chúng tôi xin có kiến nghị như sau:
- Tiếp tục nghiên cứu phân lập các hợp chất trong loài cỏ Bách linh.
- Sàng lọc các hoạt tính sinh học khác như hoạt tính kháng viêm, kháng vi sinh vật,....
TÀI LIỆU THAM KHẢO + TIẾNG VIỆT
[1] Trần Thế Bách. Chi Hàm Liên – Marsdenia R. Rr (Họ Thiên Lý – Asclepiadceac R. Rr) Ở Việt Nam. Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ hai. Trang 32 đến 36.
[2] Đỗ Tất Lợi. 2014. Từ điển Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB KHKT. [3] Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu, 1978. Các phương pháp nghiên cứu
Hóa học cây Thuốc, NXB KHKT
+ TIẾNG ANH
[4] Aalok Kumar, Anakshi Khare*, Naveen K. Khare. 1999. Trisaccharides From Marsdenia Roylei. Phytochemistry 52, pp 675- 679
[5] Alan G.Duff,Emery Gellert And Richard Rudzats. 1973. New Ketopolyhydroxypregnene From Marsdenia Flavescens. Phytochemistry V1o2l. pp 2943 - 2945
[6] An-Yuan Zhang, Xin Huang, Ai-Min Tan*, Shi-Bo Yang, and Hua Zhang. 2010. Three New C21 Steroidal Glycosides from the Stems of Marsdenia tenacissima. Helvetica 2256 Chimica Acta – Vol, pp 2256 - 2262
[7] Binxin Lina, Xinling Lua,b, Nan Lia, Ning Xua, Jin-Ming Lin. 2020.Effect
Of Dai-Bai-Jie On The Proliferation And Migration Of The A549 Cells .
Chinese Chemical Letters 31. pp 476–478
[8] Bin Xie. 2019. Tenacigenin B Ester Derivatives From Marsdenia tenacissima Actively Inhibited Cyp3a4 And Enhanced In Vivo Antitumor Activity Of Paclitaxel. Volume 23510. pp 309-319
[9] Can Zhao. 2020. Marsdenia tenacissima Extract Promotes Gefitinib Accumulation In Tumor Tissues Of Lung Cancer Xenograft Mice Via Inhibiting Abcg2 Activity. Journal Of Ethnopharmacology. Volume 255 [10] D. Venkata. 1969. Constituents Of The Bar K Of Marsdenia Volubilis.
[11] Emma Maldonado. 2013. Chemical ConstituentsFrom Marsdenia Roylei.
Biochemical Systematics And Ecology. Volume 48. pp 219-221
[12] Han, S. Y.; Zhao, H. Y.; Zhou, N.; Zhou, F.; Li, P. P., Marsdenia tenacissima extract inhibits gefitinib metabolism in vitro by interfering with human hepatic CYP3A4 and CYP2D6 enzymes. J Ethnopharmacol 2014, 151, 210-217.
[13] Hua Zhang∗, Ai-Min Tan∗∗, An-Yuan Zhang, Rong Chen, Shi-Bao Yang, Xing Huang. 2010. Five New C21 Steroidal Glycosides From The Stems Of Marsdenia Tenacissima. Steroids 75,pp 176–183.
[14] Hua Zhanga)b), Ai-Min Tan*a), Feng Fengb), Shi-Bao Yanga), An-Yuan Zhanga), and Xin Huang. 2008. Two New C21 Steroidal Glycosides from the Stems of Marsdenia tenacissima. Helvetica Chimica Acta – Vol. 91, pp 1489–1490
[15] Hu, Y. J.; Shen, X. L.; Lu, H. L.; Zhang, Y. H.; Huang, X. A.; Fu, L. C.; Fong, W. F., 2008. Tenacigenin B Derivatives Reverse P-Glycoprotein- Mediated Multidrug Resistance In Hepg2/Dox Cells. J Nat Prod 71.Pp 1049-1051.
[16] Jing Liu A, Zhi Bin Yu A, Yun Hua Ye B, Ya Wei Zhou. 2008. A New C21 Steroid Glycoside From Marsdenia Tenacissima. Chinese Chemical Letters 19, pp 444–446
[17] Jin-Lan Yuan, Zhi-Zhen Lu,* Gui-Xian Chen, Wei-Pei Ding, Bing-Nan Zhou, Clemens A. J. Erdelmeier,Matthias 0. Hamburger, Ji Harry H. S. Fong~ And Geoffrey A. Cordell. 1992. The Pregnane Glycoside Marsdekoiside A From Marsdenia Koi. Phgrochem Stvroyl,. 31,N O 3, pp. 1058-1060
[18] Juanjuan Chena, Xiaoyu Li B, Cuirong Suna, Yuanjiang Pana,∗, Urs Peter Schlunegger. 2008. Identification Of Polyoxypregnane Glycosides From The Stems Of Marsdenia tenacissima By High - Performance Liquid Chromatography
[19] Jun Deng, Zhixin Liao, and Daofeng Chen. 2005. Three New
Polyoxypregnane Glycosides from Marsdenia tenacissima. Helvetica chimica acta – Vol. 88, pp 2675 - 2682
[20] Jun Deng, Zhixin Liao, Daofeng Chen. 2005. Marsdenosides A–H, Polyoxypregnane Glycosides From Marsdenia tenacissima .
Phytochemistry 66, pp 1040–1051
[21] Jun Deng. 2006. Quantitation Of Seven Polyoxypregnane Glycosides In Marsdenia tenacissima Using Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light-Scattering Detection. Journal Of Chromatographya. Volume 1116. pp 83-88
[22] Kaiyan Zheng. 2014. Analysis Of The Transcriptome Of Marsdenia tenacissima Discovers Putative Polyoxypregnane Glycoside Biosynthetic Genes And Genetic Markers. Genomics. Volume 104. pp 186-193
[23] Lin Sen-Sen 1, Li Fang-Fang 1δ, Sun Li 1*, Fan Wei 1, Gu Ming 1, Zhang Lu-Yong 1,Qin Song 2, Yuan Sheng-Tao. 2016. Marsdenia tenacissima Extract Suppresses A549 Cell Migration Through Regulation Of Ccr5-Ccl5 Axis, Rho C, And Phosphorylated Fak. Chinese Journal Of Natural Medicines. 14(3). pp 0203-0209
[24] Lixiaohua. 2018. Ethyl Acetate Fraction In Ethanol Extract From Root Of "Dai-Bai-Jie" (Marsdeniatenacissima). Jtraditchin Med 38. pp 668-675. [25] Qi Fa Li A, Xiao Ling Wang A, Li Sheng Ding B, Chang Zhang. 2007.
Polyoxypregnanes From The Stems Of Marsdenia Tenacissima. Chinese Chemical Letters 18, pp 831–834
[26] Qiu Sheng-Xiang, Gong Yong And T. A. Cheung. 1993. A Triterpene From a4arsdenia Globifera. Phytochemistry, Vol. 34, No. 5, pp. 1385-1387.
[27] Qiu Sheng - Xiang. 1996. Further Polyoxypregnanes
[28] S.H. Kim. 2015. Histogram Analysis Of Apparent Diffusion Coefficients After Neoadjuvant Chemotherapy In Breast Cancer. The Catholic University Of Korea, Republic Of Korea.Vol51.
[29] Sheng Yao A,B,1, Kenneth Kin-Wah To B,C,1, Liang Maa,B, Chun Yin B,D, Chunping Tang A,B, Stella Chai B,D,Chang-Qiang Ke A,B, Ge Lin B,D,⇑, Yang Ye. 2016. Polyoxypregnane Steroids With An Open-Chain Sugar Moiety From Marsdenia tenacissima And Their Chemoresistance Reversal Activity. Phytochemistry 126, pp 47–58
[30] Sheng Yao, Kenneth Kin-Wah, Liang Maa, Chun Yin, Chunping Tang , Stella Chai, Chang-Qiang Ke, Ge Lin, Yang Ye. 2016. Polyoxypregnane Steroids With An Open-Chain Sugar Moiety From Marsdenia tenacissima And Their Chemoresistance Reversal Activity. Phytochemistry. Volume 126. pp 47-58
[31] Sheng-Xiang Qru, Si-Qi Luo,T Long-Ze Lin And Geoffrey A. Cordell. 1996. Further Polyoxypregnanes From Marsdenia Tenacissima. Phyrochemisrry, Vol 41. No. 5, Pp 1385 1388
[32] Shobha Singhal, Maheshwari P. Khare And Anakshi Khare. 1980.
Tenasogenin, A Pregnane Ester From Marsdenia Tenacissima. Phytochemistry. Volume 19. pp 2431-2433
[33] Shuji Miyakawa, Kimiko Yamaura, Koji Hayashi, Koh Kaneko And Hiroshi Mitsuhashi. 1986. Five Glycosides From The Chinese Drug ‘Tong-Guang- San’: The Stems Of Marsdenia tenacissima . Phytochemistry. Volume 25. pp 2861-2865
[34] Shu-Yanhana, Weizhaoa, Hongsuna, Ningzhoua, Feizhoua, Guoana, Ping-Pinglia. 2015. Marsdenia tenacissima Extract Enhances Gefitinib Efficacy In Non-Small-Cell Lung Cancer Xenografts. Phytomedicine 22.pp 560–567
[35] Si-Qi Luo,* Long-Ze Lin, Geoffrey A. Cordell,T Liang Xue~ And Michael E. Johnson. 1993. Polyoxypregnanes From Marsdenia Telvacissima.
Phytochmistry, Vol. 34, No. 6, pp 1615 - 1620
[36] Vijay S. Gupta, Alok Kumar, Desh Deepak, Anakshi Khare, Naveen K. Khare. 2003. Pregnanes And Pregnane Glycosides From Marsdenia Roylei. Phytochemistry 64,pp 1327–1333
[37] Xiao-Ling Wang, Qi-Fa Li, Kai-Bei Yu, Shu-Lin Peng, Yan Zhou, and Li- Sheng Ding. 2006. Four New Pregnane Glycosides from the Stems of Marsdenia tenacissima. Helvetica 2738 Chimica Acta – Vol. 89, pp 2738 - 2744
[38] Xu Pang A,B, Li-Ping Kang C,D,⇑, He-Shui Yu D, Yang Zhao A, Li-Feng Han D, Jie Zhang A, Cheng-Qi Xiong A,Li-Xia Zhang E, Li-Yan Yu B, Bai-Ping Maa. 2015. New Polyoxypregnane Glycosides From The Roots Of Marsdenia Tenacissima. Steroids 93,pp 68–76
[39] Xu Wu. 2017. Beneficial Anticancer Effect Via Pharmacokinetic Interaction Of Combinational Use Of Paclitaxel With Marsdenia tenacissima Polyoxypregnanes. Drug Metabolism And Pharmacokinetics. Volume 32.pp