2. Mục tiêu của đề tài
1.5. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các loài trong chi Marsdenia
- Thành phần hóa học chính của loài trong chi Marsdenia là Triterpen, Glycoside; Polyoxyregnanes steroid. Các hợp chất này có tác dụng chủ yếu trong việc chống oxi hóa, hoạt tính kháng viêm, ức chế tế bào ung thư [7-41]
- Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học chủ yếu tập trung vào loài Marsdenia tenacissima.
+ Từ những năm 1970, dịch chiết loài M. tenacissima extract đã được thử nghiệm ức chế tế bào ung thư. Đến nay, có nhiều công trình đã công bố về thử nghiệm ức chế tế bào ung thư. Đến nay, có nhiều công trình đã công bố về thử nghiệm in vitro và in vivo khả năng ức chế tế bào ung thư của dịch chiết và chất phân lập được.
Bảng 1.8 Hoạt tính ức chế tế bào ung thư của dịch chiết tổng M. tenacissima
In vitro
TLTK
Mô hình Kết quả
Trong invitro, hoat động ức chế tăng trưởng lymphoma ác tính ung thư thục quản, ung thư phổi, dạ dày, gan và ung thư cổ tử cung
Chiết xuất của M. tenacissima thể hiện hoạt tính ức chế các dòng tế bào ung thư (% tỷ lệ ức chế) : U lymphoma ác tính (40,0%), ung thư thục quản (26,3%), ung thư phổi (21,4%), ung thư dạ dày (26,7%),ung thư gan (33,3%) và ung thư cổ tử cung (50,0%)
Invivo
Hoạt động ức chế tăng trưởng ở chuột
- Dòng tế bào: Cấy ghép dòng ung thư tế bào dạ dày
S180, các tế bào ghép chuột dòng H22, ghép tế bào ung thư dạ dày dòng P388. - Kiểm soát: Cyclophosphamide (25 mg/kg). Liều lượng: 18, 9, và 4.5 mg/kg điều trị trong 10 ngày.
Tỷ lệ ức chế (%):
- Tế bào ung thư dạ dày S180 (18, 9, và 4.5 mg/kg): 41.06, 39.74, và 22.52 (%).
- Cấy ghép tế bào H22 (18, 9, và 4.5 mg/kg): 49.32, 32.04, và 22.3 (%). - Cấy ghép tế bào ung thư dạ dày
P388 (18, 9, và 4.5 mg/kg): 42.28, 32.52, và 25.20 (%).
Tác dụng chống ung thư chuyển gen Adenoviral p53 qua trung gian của 1 khối u ác tính ở chuột mô hình
- Dòng tế bào: Tế bào chuột
H22
- Liều lượng:
4 mL/chuột/ngày (0.1M) trong 7 ngày.
Tỷ lệ (%)
-p53 + Chiết xuất M. tenacissima: 5.43 (%).
- Chiết xuất M. tenacissima: 2.24 (%).
p53: 3.69 (%).
Đột biến chống ung thư và khối u ở chuột: - Dòng tế bào: S180, và các tế bào H22. Trọng lượng đột biến: - Dòng S180 (Liều lượng: 0.1, 0.2, và 0.4 mg/mL): 1.84, 1.61, và 1.52 (g), và kiểm soát (3.42 g).
Cyclophosphamide (40 mg/kg).
Liều lượng: 0.1, 0.2, và 0.4 mg/mL, 1 mL/lần, 2
lần/ngày trong 24 ngày.
và 0.4 mg/mL): 1.89, 1.68, và 1.54 (g), và kiểm soát (3.58 g).
+ Ngoài ra “Ai-xiao-ping” được lấy ra từ chiết xuất của M. tenacissima, đã được chứng minh bởi SFDA năm 1987. Nó được sử dụng để điều trị khối U ác tính tiêu hóa, đặc biệt là ở gan nguyên phát, ung thư thực quản và ung thư dạ dày, ung thư phổi trong phòng khám. Nó cũng có tác dụng chống khối u khi kết hợp với các phương pháp điều chị khác như Hóa trị, Xạ trị.
+ Mặt khác, chiết xuất M. tenacissima còn có tác dụng trên các hệ thống miễn dịch như tế bào lymphoma. Chiết xuất M. tenacissima có thể thúc đẩy sự phát triển của tế bào T và B trong các tế bào miễm dịch bình thường với nồng độ không gây độc tế bào. Nó cũng được sử dụng cho việc điều trị viêm phế quản mãn tính, viêm phổi, viêm tá tràng, viêm dạ dày, viêm thận vv.
+ Thân cây của Marsdenia tenacissima từ lâu đã được sử dụng rộng rãi như một loại thuốc điều trị ung thư tại Trung Quốc. Kết quả in vitro cho thấy rằng chiết xuất từ Marsdenia tenacissima (MTE) vượt qua sức đề kháng trong các tế bào ung thư phổi. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự kết hợp giữa gefitinib và MTE có thể là một phương pháp đầy hứa hẹn để tăng cường hiệu quả quá trình điều trị ung thư và hỗ trợ điều trị kháng đa thuốc [23-24, 38-41]. Mô hình xenograft khối u in vivo NSCLC chuột nude BAALB/c trong 6 đến 8 tuần tuổi được lấy từ Vital River Laboratory animal Technology Co. Ltd. (Bắc Kinh, Trung Quốc). Các con vật được nhốt trong các tủ lưu chuyển không khí nhiều tầng trong điều kiện không có mần bệnh với chu kỳ sáng/tối 12 giờ và được cho ăn thức ăn tự động tiêu chuẩn và nước uống tự chế. Giao thức thí nghiệm trên động vật đã được phê duyệt bởi Ủy ban nghiên cứu động vật của Đại học Bắc Kinh và được thực hiện theo hướng dẫn của cộng đồng châu
Âu. Các tế bào H460 (5x105) hoặc H1975 (2x106) của con người đã bị đình chỉ trong 0,2 ml PBS pha 1:1 với Matrigel (Sinh học) và tiêm dưới da vào bên phải chuột. Tăng trưởng khối u đã được đo và khối lượng khối u được tính theo công thức sau: Khối lượng khối u (mm3) = 0,5 X chiều dài X chiều rộng. Khi khối lượng khối u đạt Jappro xấp xỉ 50-100mm, chuột được chia thành các nhóm điều trị khác nhau (n=7). Trọng lượng cơ thể của chuột đã được đo, các khối u được cắt bỏ sau khi các con vật bị hiến tế, mô khối u được cố định trong fomalin để phân tích hóa mô miễm dịch hoặc được lưu trữ ở -700C để phát hiện protein [34, 39-41].
Tác dụng của MTE và gefitinib kết hợp đối với sự phát triển của xenograft khối u NSCLC. Chuột mang khối u được chia ngẫu nhiên thành bốn nhóm: Nhóm I được xử lý bằng dung môi MTE làm đối chứng; các nhóm II-IV được tiêm trong màng bụng (ip) với MTE với liều 5, 10 hoặc 20g/kg mỗi động vật trong 21 ngày liên tiếp. Dựa trên nghiên cứu này 5 g MTE đã được sử dụng kết hợp với gefitinib để đánh giá hiệu quả chống khối u của chúng trên chuột xenograft, chuột mang theo một cách ngẫu nhiên được chia thành bốn nhóm: Nhóm I đóng vai trò kiểm soát phương tiện; Nhóm II nhận được 50 mg/kg gefitinib được sử dụng trong 0,3% Tween-80 bằng cách quản lý bằng ống [34]; Nhóm III được điều trị bằng 5 g/kg MTE (ip); Nhóm IV nhận được 5g MTE trong 12 giờ sau đó là 50 g/kg gefitinib vào ngày đầu tiên và sau đó được điều trị hai loại thuốc trong những ngày tiếp theo. Mỗi nhóm nhận được điều trị trong 21 ngày liên tiếp. Sau khi so sánh và phân tích kết quả thực nghiệm nhận thấy: Bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến mang gen đột biến EGFR thường phản ứng với gefitinib hoặc erlotinib nhưng luôn phát triển khả năng chống lại các thuốc này. Afatinib một TKI không thể đảo ngược, đơn độc hoặc kết hợp với cetuximab có hiệu quả ở những bệnh nhân mắc phải tình trạng kháng erlotinib hoặc gefitinib [34, 40-41].
Tuy nhiên cá thể thử nghiệm aftinib cộng với cetuximab vẫn phát triển bệnh. Do đó, một chiến lược điều trị tiềm năng trong điều trị bệnh nhân kháng TKIS khẩn
thể xuất hiện hiện tượng quang sai đường truyền tín hiệu. Đồng thời nhắm mục tiêu nhiều con đường có thể giúp ức chế các tế bào khối u và làm chậm sự khởi đầu của kháng thuốc. Việc nghiên cứu các tác dụng và cơ chế của các sản phẩm TCM kết hợp với các chất chiết xuất nhắm mục tiêu tới các phân tử mới của Marsdenia tenacissima đã được báo cáo là có tác dụng ức chế sự phát triển ung thư và gây ra apoptosis và chống tạo mạch trong dòng tế bào ung thư. Huang và cộng sự đã báo cáo rằng MIE tăng cường hiệu quả của gefitinib cả trong tế bào NSCLC kháng và nhạy cảm. Tuy nhiên tác dụng chống khối u in vivo của MTE và gefitinib kết hợp chưa được biết đến [23, 34, 39-40].
Trong nghiên cứu này thấy rằng, MTE tạo ra phụ thuộc vào liều ức chế tăng trưởng xen kẽ NSCLC và gây ra apoptosis tế bào. Western blot tiết lộ rằng MTE có thể ngăn chặn quá trình phosphoryl hóa của EGFR và C-Met, cũng như kích hoạt các con đường xuôi dòng của họ, như PI3K/Akt/MTOR ở mức 20 g/kg là liều hiệu quả nhất, trong khi MTE 5 g/kg có hiệu quả không đáng kể. Liều thấp MTE (5 g/kg) có thể tăng cường tác dụng chống khối u của gefitinib trong xenograft kháng NSCLC như được chỉ định bởi trọng lượng khối u giảm. Chỉ số PCNA và phân tích TUNEL cho thấy rằng hiệu quả chống tăng sinh và chống apoptosis có thể góp phần làm giảm chứng đau bụng sau khi điều trị bằng MTE cộng với điều trị bằng gefitinib. Người ta ngày càng nhận ra rằng khả năng kháng ung thư có thể được gây ra bằng cách kích hoạt nhiều con đường kinase. Việc bãi bỏ quy định của con đường PI3K/Akt/MTOR góp phần phát triển và duy trì ung thư phổi. Con đường PI3K/Akt cũng thúc đẩy kháng gefitinib trong ung thư phổi với K-ras đột biến. Tái kích hoạt ERK qua trung gian Src có thể đóng một vai trò trong cơ chế kháng gefitinib mới. c-Met và EGFR có tác dụng dự phòng đối với tiến trình chu kỳ tế bào, apoptosis, vận động và di căn là mục tiêu tiềm năng liệu pháp phối hợp [23, 34, 41].
Phần Ethyl Acetate trích xuất trong chiết xuất Ethanol từ "Dai-Bai-Jie"
pháp SRB được sử dụng để đánh giá hoạt động gây độc tế bào. Nhuộm V-FITC của phụ lục được áp dụng để quan sát quá trình apoptosis và phân tích chu kỳ tế bào được kích hoạt bởi EFA trong tế bào khối u A549. Western blot đã được sử dụng để phát hiện các biểu hiện apoptosis/protein liên quan. Mô hình chuột nude tế bào khối u A549 đã được sử dụng để đo khối lượng khối u, trọng lượng chuột và tỷ lệ ức chế khối u để xác minh hoạt động chống ung thư trong cơ thể. Kết quả DBJ – 1 và EFA cho thấy hoạt động gây độc tế bào tốt hơn trên các tế bào khối u A549 với IC50 25 và 3,5pg/ml, tương ứng. EFA có biểu hiện sự tăng sinh, bắt giữ chu kỳ tế bào ở giai đoạn GO/GI và gây ra apoptosis trong các tế bào khối u A549 trong ống nghiệm. Các cơ chế gây ra apoptosis bởi EFA có thể liên quan đến việc giảm biểu hiện protein Bcl-2 và tăng biểu hiện protein p53, Bax, Caspase-3 và Caspase-8. EFA cũng sở hữu hiệu quả khả năng chống khối u đáng kể ở chuột nude và ít thấy độc tính ở vật chủ [24].
Di căn là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở bệnh nhân ung thư. Mặc dù cơ chế điều chỉnh di căn ung thư vẫn chưa rõ ràng, nhưng người ta thấy rằng một số loại ung thư thường xâm chiếm một số cơ quan đặc biệt [16-18]. Ví dụ di căn ung thư phổi phần lớn chỉ giới hạn ở xương, gan và não, hay sự di căn của khối u ác tính ở mắt hầu như chỉ giới hạn ở gan. Số phận của các tế bào ung thư lưu hành phổ biến và xâm nhập vào các địa điểm chủ yếu được quyết định bởi môi trường vi mô chủ. Chemokine là những chất điều hòa chính có thể thể cung cấp lợi thế độc nhất để hỗ trợ di căn ung thư, các Chemokine là một họ protein nhỏ có chứa một họ cysteine bảo tồn cấu trúc tương đồng bằng cách liên kết với các thụ thể nhận thức của họ, Chemokine điều chỉnh việc tuyển dụng các tế bào đơn nhân, đại thực bào và các tế bào viêm khác vào các vị trí viêm. Ngoài vai trò trong các phản ứng viêm, sự điều chỉnh của Chemokine và các thụ thể của chúng đã chứng minh là thúc đẩy sự phát triển và tiến triển của ung thư thông qua nhiều cơ chế, bao gồm tăng cường di căn, tăng sinh mạch và tuyển dụng tế bào miễm
(CXCR4) đáp ứng với yếu tố có nguồn gốc tế bào stromal Chemokine 1 được sản xuất dồi dào ở các cơ quan xa. Trong khi đó thụ thể hóa học CXC 6 (CXCR6) biểu hiện cao trong di căn hạch ung thư vú và đóng góp đáng kể vào tế bào. Nhiều vai trò của chemokine trong việc thúc đẩy khối u làm cho chúng trở thành mục tiêu điều trị hấp dẫn trong trong điều trị ung thư. Marsdenia tenacissima (MT) (Roxb.) Wight et Arn., thường được gọi là “Tong Quan Teng”, một loại thảo dược truyền thống ở Trung Quốc, phân bố rộng rãi ở tỉnh Vân Nam của Trung Quốc [8-13]. MT từ lâu đã được sử dụng làm thuốc thảo dược để điều trị hen suyễn, ung thư, viêm khí quản, viêm amidan, viêm họng, viêng bàng quang và viêm phổi. Chiết xuất Ethanolic của Marsdenia tenacissima được báo cáo là có tác dụng chống khối u mạnh đối với các tế bào tân sinh huyết học và gây ra apoptosis trong ống nghiệm và in vivo. Nó cũng được chứng minh là ức chế sự hình thành khối u bằng cách nhắm vào đường dẫn tín hiệu VEGF/VEGFR trong tĩnh mạch rốn của con người. Chiết xuất Marsdenia tenacissima đã được phê duyệt để điều trị ung thư dạ dày, ung thư phổi và ung thư tế bào gan của cơ quan quản lý dược phẩm Trung Quốc (SPDA). Theo truyền thống Marsdenia tenacissima được sử dụng như một phương thuốc hiệu quả để điều trị ung thư ở Trung Quốc. Bằng chứng ngày càng tăng đã chứng minh rằng chất chiết xuất MT có tác dụng chống ung thư đáng kể trong bệnh bạch cầu, ung thư phổi và ung thư biểu mô tế bào gan. Mặc dù MT đã cho thấy độc tính tế bào hứa hẹn chống lại các khối u nguyên phát, nhưng tác dụng của nó đối với sự di căn của ung thư vẫn chưa được biết rõ.
Trong nghiên cứu của mình các tác giả Lin [23] và cộng sự đã chứng minh khả năng chống di căn tế bào ung thư phổi (lung cancer anti-metastatic ) của cao XAP chiết xuất từ loài Marsdenia tenacissima ( MTE ). Nghiên cứu cho thấy XAP ức chế sự di chuyển và xâm lấn của tế bào ung thư phổi A549 thông qua điều hòa làm giảm trục CCR5-CCL5. Rho C và FAK. Các chemokine và các thụ thể của chúng là những nhân tố chính trong việc bảo vệ miễn dịch bằng cách chỉ đạo và kiểm soát sự di chuyển,
kích hoạt, biệt hóa và sự sống của các tế bào bạch cầu. Vai trò của thúc đẩy khối u của trục CCR5-CCL5 đã được nghiên cứu chuyên sâu ở nhiều bệnh ác tính. Họ cũng tiếp tục chỉ ra rằng XAP cũng ức chế sự biểu hiện của Rho C và sự phosphoryl hóa FAK, đó là các tín hiệu ở hạ lưu của trục CCR5 – CCL5 [23].
Những kết quả này cho thấy trục CCR5 – CCL5 đóng vai trò quan trọng trong hiệu ứng chống di căn của XAP. Sự gắn kết của chemokine với các thụ thể nhận thức của chúng kích hoạt các protein G có thể kích hoạt các tầng tín hiệu khác nhau làm phát sinh sự di chuyển tế bào. Cụ thể hơn, trục CCR5 – CCL5 có thể kích hoạt các con đường như PI3K-Akt, MAPK, ERK1/2, FAK và tích lũy các GTPase nhỏ, Rac, Cdc42 và cuối cùng là trùng hợp Actin và hình thành F- actin. Họ cũng chỉ ra rằng XAP làm giảm đáng kể nồng độ Pho C và FAK phosphorylated điều tiết xuống vừa phải, và XAP không làm thay đổi tín hiệu phosphorylationofp38 MAPK và ERK. Kết quả của nghiên cứu cho thấy một mình XAP không gây ra bất kỳ thay đổi nào trong quá trình phosphoryl hóa PI3K/Akt/MTOR và ERK trong các dòng tế bào ung thư phổi không phải tế bào nhỏ NCI-H460 và NCI-H1975. Điều thú vị là mặc dù cơ chế của XAP đối với sự di căn vẫn chưa được biết nhưng XAP đã được chứng minh là làm giảm quá trình phosphoryl hóa PI3K/Akt/MTOR và ERK trong các dòng tế bào ung thư phổi khác như H292 và HCC827. Sự khác biệt giữa các kết quả thực nghiệm có thể là do độ nhạy khác nhau của các dòng tế bào ung thư thư phổi với XAP. Các dòng tế bào ung thư phổi không phải tế bào nhỏ ở người (NSCLC) Các tế bào HCC827
và H292 nhạy hơn với XAP được chứng minh bằng các hiệu ứng độc tế bào đáng kể trong các dòng tế bào. Tuy nhiên nồng độ XAP mà nhóm nghiên cứu sử dụng không đủ để ảnh hưởng đến các con đường khác ngoài Rho C và FAK bởi vì 20mg/ml XAP thậm chí còn thấp hơn các giá trị ước tính IC15, như được xác định bằng xét nghiệm MTT. Như vậy có thể khẳng định XAP ức chế đáng kể sự di