2. Mục tiêu của đề tài
2.1.2. Hóa chất và tế bào dùng để thử hoạt tính sinh học
-FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), sRB (Sigma).
-Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pippette (eppendorf), máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-rad).
-Chất tham khảo: Ellipticine. -Các hóa chất thông thường khác.
-Các dòng tế bào ung thư do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.
2.1.3. Thiết bị.
-Máy cất quay chân không, các thiết bị phụ trợ cho thí nghiệm phân lập chất hữu cơ.
- Máy đo khối phổ Mass Spectrometter (LC-MS) (Viện Hóa học - Viện Hàm lâm KHCN Việt Nam).
- Máy Bruker 500MHz để đo Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Khoa Hóa học - Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội).
- Hiện màu với thuốc thử là dung dịch C2H5OH/H2SO4 và đèn UV 254nm. Cân phân tích, máy đo OD ELISA Plate Reader (Bio-Rad).
- Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích được tiến hành trên bản mỏng kính và bản mỏng nhôm silica gel tráng sẵn (dày 0.2 mm).
2.2. Phương pháp sử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các chất phân lập được.
2.2.1. Mẫu nghiên cứu và xử lý mẫu thực vật.
-Cây cỏ Bách Linh được thu hái vào khoảng tháng 7 tại huyện Bảo Yên tỉnh Lào Cai, năm 2019 là các mẫu tươi. Tên loài thực vật và mẫu được PGS. TS. Sỹ Danh Thường công tác tại Khoa Sinh Học/ Phòng khảo thí và kiểm định chất lượng trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên xác định.
-Mẫu được sấy khô ở 50oC trong 72h, bảo quản trong túi nilon dùng để nghiên cứu.
2.2.2. Chiết xuất
-7 kg mẫu khô cây Cỏ Bách Linh được đem cắt nhỏ, sấy khô và chiết nóng với ethanol 90% ở nhiệt độ 80oC trong thời gian là 3 giờ và lặp lại 3 lần. Cất thu hồi dung môi được cặn chiết ethanol (1.1 kg).
-900 g cao chiết ethanol được phân bố đều trong nước và chiết lần lượt với DCM, EA và n-BuOH, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 90 gam cao DCM, 110 g cao EA, 125 g cao n-BuOH và phần nước. Phân lập cặn tổng số và các cặn ở các phân đoạn bằng phương pháp sắc kí cột trên silica gel với các hệ dung môi thích hợp.
2.2.3. Phương pháp định tính các nhóm hợp chất. [3]
2.2.3.1. Định tính polyphenol [3.]
-Phản ứng với muối sắt (III).
Tùy theo số lượng và vị trí các nhóm hidroxyl trong phân tử polyphenol mà cho các màu lục, xanh hoặc nâu.
Khi nhỏ H2SO4 lên các dẫn xuất của flavone và flavonol thì cho màu vàng đậm; đối với chalcone và auron cho màu đỏ, đỏ thắm và đỏ tươi; flavanone cho màu đỏ da cam do sự chuyển thành chalcone.
2.2.3.2. Định tính các flavonoid[3.]
Thuốc thử: Dung dịch acid HCl đặc 36% và bột Mg kim loại.
Thí nghiệm: Lấy 0.05 g cặn chiết thêm 10 ml CH3OH, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2 ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg kim loại, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút và quan sát thấy dung dịch có màu từ vàng, đỏ đến xanh là dương tính với các flavonoid.
Hiện tượng: Dịch methanol có màu hồng. Khi thêm thuốc thử thì có màu hồng hơn.
2.2.3.3. Định tính alkaloid[3.]
* Các thuốc thử sử dụng. - Thuốc thử Dragendorff.
Dung dịch A: Hòa tan 0.05 g bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml dung dịch acetic acid 20%. Dung dịch B: 5 ml dung dịch KI 40% trong nước. Trước khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A, 5 ml dung dịch B và 70 ml H2O.
- Thuốc thử Mayer.
Dung dịch A: hòa tan 1.36 g HgCl2 trong 60 ml H2O. Dung dịch B: Hòa tan 5 g KI trong 10 ml H2O. Trộn hai dung dịch lại, thêm nước vừa đủ 100ml.
* Thí nghiệm: Lấy 0.05 g cặn chiết cho thêm 5 ml H2SO4 5%, khuấy đều, lọc qua giấy lọc. Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml nước lọc acid rồi thêm:
+ Ống 1: 1-2 giọt thuốc thử Dragendorff, xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính.
+ Ống 2: 3-5 giọt thuốc thử Mayer thấy xuất hiện kết tủa trắng là dương tính. * Hiện tượng:
2.2.3.4. Định tính các Courmarin[3]
* Thuốc thử: Dung dịch NaOH 10%.
* Thí nghiệm: Lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml dịch thử, cho vào một trong hai ống đó 0.5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách thuỷ đến sôi, lấy ra để nguội cho thêm 4 ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ống không kiềm có thể xem là dương tính. Nếu đem acid hoá ống nghiệm có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc mà làm cho dịch đang trong suốt hoặc có màu vàng xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra kết tủa là dương tính.
2.2.3.5. Phản ứng của Steroid[3.]
Phản ứng Liebermann - Burchardt: Cho vào ống nghiệm có chứa cặn glycoside tim 1 ml anhydride acetic, lắc đều cho tan hết cặn. Nghiêng ống 45°. Cho từ từ theo thành ống 0.5 ml sulfuric acid đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ. Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá.
2.2.4. Xác định cấu trúc các chất[3.]
Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H, cacbon 13C, phổ hai chiều HSQC và HMBC và phổ khối lượng ESI-MS.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR, MS được đo tại Khoa Hóa học - Đại Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.3. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư.
2.3.1. Vật liệu và hóa chất.
- FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), sRB (Sigma)
- Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pippette (eppendorf), máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-rad).
- Chất tham khảo: Ellipticine. - Các hóa chất thông thường khác.
- Các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen, Promega v.v.
-Các dòng tế bào do GS. J M Pezzuto, Trường Đại học Long-Island, US cung cấp.
-Các dòng tế bào sử dụng trong nghiên cứu:
+ A549: Ung thư phổi ở người (human lung carcinoma). + Hela: Ung thư buồng trứng (human ovarian carcinoma).
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro.
- Các dòng tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1.0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum - FBS (GIBCO).
- Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37℃, 5% CO2.
2.3.3. Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay)[41].
Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD - Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
-Chất thử được pha thành các dải nồng độ thích hợp.
-Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
-Chất thử đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ chất thử
- Ủ trong tủ ấm 48 giờ. Giếng không có chất thử nhưng có TBUT (180µl) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng Trichloroacetic acid - TCA.
- Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37℃, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng.
- 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút. - Đọc kết quả OD ở bước sóng 515 - 540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad).
- Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
[OD (chất thử) - OD (ngày 0)] x 100 % ức chế = 100% -
OD (đối chứng âm) - OD (ngày 0)
- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở các nồng độ 10 µg/ml; 2 µg/ml; 0.4 µg/ml; 0.08 µg/ml được sử dụng như là chất đối chứng dương.
- DMSO10% được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính Table Curve 2Dv4.
- Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), cặn chiết được coi là có hoạt tính tốt với IC50 ≤ 20 µg/ml, trong khi chất tinh khiết được coi có hoạt tính tốt khi IC50 ≤ 5 µM.
Phần hoạt tính sinh học được thử nghiệm tại Viện Hàn Lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam.
2.4. Phân lập, tinh chế các hợp chất.
Phần cao chiết EA (85 gam) tiến hành phân lập các chất trên sắc ký cột silica gel. Hòa tan lượng cao chiết EA trong ethyl acetate, sau đó cho cao chiết trộn với silica gel (Merck, cỡ hạt 63-20 µm), sấy khô và nghiền nhỏ. Nhồi cột khô silica gel (Merck, cỡ hạt 63-20 µm) vào cột sắc ký kích thước 10 x100 cm với 1 kg silicagel.
Ổn định cột bằng dung môi n-hexane. Hệ dung môi rửa giải là: n-hexane : acetone với tỉ lệ từ 25:1 – 1:2(v/v). Tiến hành sắc ký và thu được 6 phân đoạn. Tại phân đoạn 1, xuất hiện chất rắn vô định hình màu trắng, tiến hành lọc chât rắn và rửa lại với acetone thu được chất 2 (35 mg). Từ phân đoạn 5, tiến hành sắc ký cột silica gel, hệ dụng môi pha động là n-hexane/acetone với tỉ lệ là 10/1 và 1/1 (v/v) thu được 2 phân đoạn. Từ phân đoạn 5.1, tiến hành sắc ký pha đảo với hệ dung môi là acetone/nước tỉ lệ 30/70 đến 60/40 thu được chất rắn vô định hình có khối lượng 19 mg (chất 1). Các chất được làm khô để tiến hành đo phổ NMR và MS để xác định cấu trúc hợp chất và đánh giá hoạt tính sinh học (Sơ đồ 2.1).
Cao chiết EA (85 gam)
Phân đoạn 1 Phân đoạn 2 Phân đoạn 3 Phân đoạn 4 Phân đoạn 5 Phân đoạn 6
SKC Pha động: n-hexane/acetone với tỉ lệ 1:25 đến 1:2 (v/v) Chất 2 (35 mg) Lọc thu chất rắn Dịch lọc
Phân đoạn 5.2 Phân đoan 5.1
1 (19 mg) SKC Pha động: n-hexane/ acetone với tỉ lệ 10/1 – 1/1 (v/v) SKC 18, acetone/water (30/70-60/40)
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả định tính nhóm hợp chất và kết quả phân lập các hợp chất
Phân tích định tính một số hợp chất hữu cơ có trong mẫu nghiên cứu là bước nghiên cứu cần thiết trước khi tiến hành thực nghiệm phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất.
Các phản ứng hóa học được dùng để định tính được trình bày ở mục 2. Kết quả định tính một số nhóm hợp chất được tổng hợp ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả định tính một số nhóm chất hữu cơ có trong cao chiết ethanol
Số TT Nhóm chất Phản ứng Kết quả
1 Phenolic dd FeCl3 5% Chuyển màu xanh
H2SO4 đặc Hiện tượng chuyển màu đỏ nâu
2 Alkaloid Dragendoff Không rõ
Mayer Không rõ
3 Flavonoid Mg/HCl đặc Hiện tượng chuyển màu đỏ nâu
4 Coumarin NaOH đặc Không rõ
5 Steroid Liberman-Bourchar Màu xanh vàng
Qua bảng 3.1, ta thấy trong cao chiết ethanol của loài thực vật này có mặt một số nhóm hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học tốt như như hợp chất phenolic, flavonoid và steroid. Các nhóm hợp chất này có mặt trong nhiều loài thực vật đã được ứng dụng làm thuốc chữa bệnh.
3.2. Kết quả xác định cấu trúc của hợp chất
3.2.1. Phân tích cấu trúc hợp chất 1
Chất rắn 1 sau khi phân lập được tiến hành đo các phổ 1H-NMR, 13C- NMR, HMBC, MS kết hợp với các tài liệu tham khảo xác định công thức cấu
Hình 3.1. Phổ 1H-NMR của chất 1
Phổ 1H-NMR của chất 1 cho 2 tín hiệu singlet của 2 nhóm methyl liên kết với nguyên tử cacbon bậc 4 tại δH 0.89, 1.05 (s, 3H) tương ứng với các nhóm methyl tại C-18 và C-19; 01 tín hiệu cộng hưởng của nhóm methyl dạng singlet tại δH 2.27 ppm (s, 3H, C-21) tương ứng với nhóm methyl liên kết với nguyên tử Csp2 trong keton, đây là tín hiệu đặc trưng của khung pregnane dạng ketone; 02 tín hiệu cộng hưởng của các proton của 2 nhóm methyl dạng doublet tại liên kết với nhóm methin (CH) tại δH 1.39 (d, J = 6.2 Hz, 3H) và 1.27 (d, J = 7.0 Hz, 3H).
Trên phổ 1H-NMR của chất 1 còn xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của các phân tử đường, điển hình như: δH 4.81 (d, J = 8.2 Hz, 1H) và 4.60 (d, J = 9.5 Hz, 1H) là 2 nguyên tử proton ở nguyên tử cacbon C1’ và C1’’ dạng cấu hình β – do có hằng số tách spin-spin J < 10 Hz [14-16]. Các nguyên tử proton khác của các phân tử đường cộng hưởng trong khoảng từ 3.0 – 4.0 ppm.
Bảng 3.2: Giá trị độ chuyển dịch hóa học của chất1 (δ ppm, J Hz) Vị trí δC δH 1 38.06 1.53-1.54 (1H, m) 1.21-1.23 (1H, m) 2 28.93 1.83-1.85 (1H, m) 1.45-1.51 (1H, m) 3 72.83 3.41-3.45 (1H, m) 4 34.45 1.82- 1.85 (m, 2H) 5 44.50 2.23-2.35 (1H, m) 6 27.03 1.34-1.38 (1H, m) 1.47-1.51(1H, m) 7 32.50 1.63-1.68 (1H, m) 2.02-2.05 (1H, m) 8 65.96 9 53.25 2.32-2.34 (m, 1H) 10 39.17 11 76.77 5.04 (m, 1H) 12 30.96 2.35 (m, 1H), 13 46.01 14 71.28 15 27.86 1.53-1.57 (m, 1H) 1.68-1.71 (m, 1H) 16 25.36 1.57-1.62 (m. 1H) 2.05-2.10 (m, 1H) 17 63.90 2.94 (s, 1H) 18 10.30 0.89 (3H) 19 12.75 1.05 (3H) 20 213.37 21 30.37 2.27 (s, 3H)
1’ 99.18 4.81 (d, J = 8.2 Hz, 1H) 2’ 71.74 3.46 (m, 1H) 3’ 81.02 3.79 (m, 1H) 4’ 79.93 3.37 (m, 1H) 5’ 67.78 3.57 (m, 1H) 6’ 17.88 1.39 (d, J = 6.2 Hz, 3H) 7’ 61.94 3.68 (s, 3H, -OCH3) Ole 1’’ 96.88 4.60 (d, J = 9.5 Hz, 1H) 2’’ 36.07 1.42 (m), 1.95 (m) 3’’ 78.81 3.69 (m) 4’’ 79.15 3.21 (m, 1H) 5’’ 70.32 3.61 (m, 1H) 6’’ 18.58 1.27 (d, J = 7.0 Hz, 3H) 7’’ 55.64 3.37 (s, 3H, -OCH3) Hình 3.2. Phổ 13C-NMR của chất1
Phổ 13C-NMR của 1 cho thấy có các tín hiệu cộng hưởng của 36 nguyên tử cacbon. Trong đó có các tín hiệu cộng hưởng của mhóm methyl liên kết với các nguyên tử C bậc 4 tại δC là 10.30 (C-18) và 12.75 (C-19); giá trị độ chuyển dịch hóa học tại 30.37 ppm (C-21) là nguyên tử C trong nhóm methyl liên kết với Csp2 của nhóm ketone, nguyên tử cacbon cộng hưởng tại δC 213.37 ppm nguyên tử C của nhóm C=O dạng ketone. Nguyên tử cacbon C-3 cộng hưởng tại độ chuyển dịch hóa học là δC 72.83 ppm, nguyên tử C-11 cộng hưởng tại
δC là 76.77 ppm. Độ chuyển dịch Hóa học của hai nguyên tử cacbon của dị vòng 3 cạnh là C8 và C-14 là 65.96 và 71.28 ppm. So sánh các tín hiệu cộng hưởng của các nguyên tử cacbon trên với tài liệu tham khảo [14-16] nhận thầy đây là khung pregnane của nhóm steroid C-21, đây là khung đặc trưng của chi thực vật Marsdenia.
Hai tín hiệu cộng hưởng của hai nguyên tử cacbon C-1’ và C-1’’ của hai phân tử đường lần lượt là 99.18 và 96.88 ppm; các phân tử đường có nhóm methyl bậc 2 cộng hưởng tại 17.88 và 18.58 ppm. Để xác định chính xác loại được chúng tôi đã tiến hành thủy phân trong dung dịch HCl 1M trong 40 phút và đối chiếu với các phân tử đường chuẩn là 6-Deoxy-D-allopyranose (Allo) và D-olenadropyranose (Ole) nhận thấy đường có trong dung dịch thủy phân là hai đường trên bằng phương pháp TLC. Trên phổ 13C-NMR của chất 1 còn xuất hiện hai nhóm methyl liên kết với oxi với độ chuyển dịch hóa học của