Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Đặc điểm của defensin và gen defensin
1.3.1. Đặc điểm chung của defensi nở thực vật
Defensins thực vật là peptide cation và thuộc về một siêu họ lớn của các peptide kháng khuẩn được tìm thấy trong các sinh vật. Khi gen mã hóa defensin
thực vật hoạt động sẽ tổng hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến chức năng kênh protein màng, làm suy yếu vi sinh vật, tăng cường khả năng chống chịu kém, làm thay đổi trạng thái oxi hoá khử ascorbic acid và đặc biệt ức chế hoạt động của α-amylase ở côn trùng [21].
Defensin là một họ peptide cơ bản và giàu cystein gồm có 45 - 54 amino acid được tìm thấy ở nhiều đối tượng thực vật kh c nhau như: lúa mỳ, lúa mạch, đậu, cải, lúa miến và đậu xanh. Chúng thể hiện hoạt tính kh ng đối với diện rộng các nấm gây bệnh thực vật. Nhiều defensin có khả năng ức chế α- amylase, trypsin. Cấu trúc ba chiều của defensin thực vật từ nhiều nguồn dữ liệu kh c nhau đã được x c định thông qua máy quang phổ cộng hưởng từ hạt
nhân. Các defensin thực vật có chung một dạng kiểu gấp liên quan đến xoắn α và tấm gấp nếp β ba phiến không song song, được giữ ổn định bởi bốn liên kết disulfide (ngoại trừ PhD1 có năm), tạo thành dạng cystein ổn định α, β đặc trưng (Csαβ). Đặc biệt là dạng cấu trúc trưng của defensin thực vật cũng được tìm thấy ở defensin côn trùng, độc tố bò cạp và protein ngọt [25].
Thomma và cs (2002) đã nghiên cứu defensin thực vật với tác dụng kháng nấm. Đến nay, trình tự của hơn 80 gen defensin thực vật khác nhau từ các loài thực vật kh c nhau đã được nghiên cứu. Trong cây Arabidopsis thaliana, có ít nhất 13 gen defensin thực vật [30].
Caralho và cs (2011) đã nghiên cứu hoạt tính sinh học của defensin và ứng dụng của defensin trong công nghệ sinh học. Cấu trúc chính của peptide gồm 45 - 54 amino acid. Trong cấu trúc ba chiều, defensins nhỏ và hình cầu, bao gồm một chuỗi xoắn α và ba phiến gấp nếp ß và có bốn cầu nối disulfide. Disulfide thực vật hoạt động mạnh sẽ tổng hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến chức năng kênh ion, t c động đến hoạt động của α-amylase và trypsin, làm suy yếu vi sinh vật, làm thay đổi trạng thái oxi hóa khử axit ascorbic, ...[16].
Hình 1.2. Cấu trúc defensin thực vật [19]
Henrik và cs (2009) đã nghiên cứu sự phát triển và ứng dụng defensin thực vật. Các defensin thực vật được thể hiện trong c c cơ quan nội tạng khác
nhau và cung cấp một dòng đầu tiên của defensin chống lại sự tấn công mầm bệnh. Mặc dù tương t c của các defensin thực vật với tác nhân gây bệnh chưa được hiểu rõ, các peptide này có thể có mặt trong cây trồng chuyển gen, kết quả là giúp cây có thể chống lại tác nhân gây bệnh [23].
Chức năng defensin không chỉ giới hạn ở hoạt tính kháng khuẩn, nó còn tham gia vào các tín hiệu tế bào và điều hoà sự tăng trưởng. Tavares và cs (2008) đã nghiên cứu các peptide kháng khuẩn từ hoa. Đ nh gi này tập trung vào các tác nhân gây bệnh. Các peptide cation hoạt động đa dạng, bao gồm cả sự ức chế các enzyme tiêu hóa và ức chế vi khuẩn hoặc nấm. Trong nghiên cứu này, đã so s nh được peptide có cấu trúc bậc 3 phân lập từ một số loài hoa. Ngoài ra còn nghiên cứu sự tương t c phân tử giữa các peptide và các tác nhân gây bệnh, trong đó bao gồm vai trò của protein màng tế bào và chất béo. Các nghiên cứu về c c peptide đã góp phần giúp chúng ta hiểu về cơ chế kháng bệnh giúp tạo cây trồng chuyển gen góp phần cải thiện giống cây trồng tăng sức đề kháng tác nhân gây bệnh [29].
Defensin thực vật có khả năng ức chế α-amylase, trypsin, và hai hoạt tính này liên quan đến cơ chế kháng sâu bệnh. Trong quá trình tiến hóa, thực vật đã sản sinh ra nhiều loại chất ức chế α-amylase, trypsin và một trong số đó là chất ức chế α-amylase 1 (α-AI1) ở đậu Hà lan (Pisum sativum) chuyển gen có khả năng kh ng hoàn toàn sâu mọt [25].
Dựa vào hoạt tính kh ng α-amylase sâu bọ defensin thực vật có thể được chia làm 2 nhóm phụ: nhóm có khả năng ức chế α-amylase và nhóm không có khả năng đó α-amylase được phát hiện thấy ở nhiều đối tượng động vật, thực vật, côn trùng và vi sinh vật, và chúng thủy phân liên kết α-1,4 glucose trong c c polymer như tinh bột, và do vậy đóng vai trò chính trong trao đổi carbohydrate [25].
1.3.2. Các nghiên cứu về defensin ở đậu xanh
Cấu trúc
Defensin đậu xanh (Vigna radiate plant defensin 1 - VrD1) là loại defensin thực vật đầu tiên có hoạt tính trừ sâu (kháng sâu bệnh) được công nhận. VrD1 có ở trong hạt đậu xanh có khả năng kh ng mọt, bao gồm 46 gốc peptide với bốn liên kết disulfide [25].
VrD1 bộc lộ thành dạng hình cầu gọn có chứa 3 tấm gấp nếp β không song song, một xoắn α, và xoắn 310. Xoắn α (α1) gồm 2 cystein bắt cặp với cystein của phiến β giữa (β3) của tấm gấp nếp β không song song (Cys19 - Cys40, Cys23 - Cys42). Hai cầu nối disulfide đó giúp duy trì sự bắt cặp của xoắn α và tấm gấp nếp β. Phiến β2 liên kết với vùng vòng L1 bởi nối disulfide thứ ba (Cys13 - Cys33). Sự hiện diện của ba liên kết disulfide này giúp cấu thành đặc điểm trung tâm của cấu trúc VrD1, hình thành kiểu mẫu CSαβ. Cầu nối disulfide thứ tự (Cys3 - Cys46) giúp kéo gần đầu N và C lại với nhau [25].
Một đặc trưng trong cấu trúc VrD1 đó là xoắn 310 (Glu8 - Gly11). So với các cấu trúc defensin thực vật đã biết khác, VrD1 là dạng đầu tiên được phát hiện có xoắn 310. Đặc điểm khác biệt nổi bật của VrD1 và các defensin thực vật khác là sự thay thế Glu26 bảo thủ cao bởi Arg.
Vai trò và cơ chế hoạt động
VrD1 là chất ức chế mạnh đối với quá trình tổng hợp protein, kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn và nấm. VrD1 là một loại peptide đa chức năng; nó thể hiện hoạt tính như là chất trừ sâu sinh học, và việc chuyển gen để kháng sâu bệnh có thể ứng dụng đối với các cây trồng nông nghiệp quan trọng. Trong các defensin thực vật, VrD1 có trình tự kh tương đồng với chất ức chế α-amylase 2 ở Sorghum bicolor (SIα2) (45% đồng nhất) [25].
VrD1 ức chế α-amylase của Tenebrio molitor, α-amylase có vai trò chủ yếu trong tiêu hóa tinh bột ở ruột các loài côn trùng, và sự biểu hiện của chất ức chế này trong đậu chuyển gen sẽ giúp kháng lại sự phá hoại của các loài mọt. Kết quả đó cho thấy hoạt tính kháng sâu bệnh của VrD1 có nền tảng cơ bản là sự ức chế thủy phân các polysaccharide. Khi so sánh trình tự và cấu trúc của hai nhóm defensin thực vật kh c nhau, người ta phát hiện ra rằng vùng vòng giữa β2 và β3 có thể là vùng gắn của α-amylase. Những kết quả thu được thông qua các thí nghiệm điện to n được sử dụng trong nghiên cứu tương t c VrD1-α-amylase cho thấy tiềm năng cải thiện hoạt tính kháng sâu bệnh của protein VrD1 [25].
VrD1 không thể hiện hoạt tính kháng trypsin, mặc dù nó có kháng TMA, điều này mở ra triển vọng sử dụng chất ức chế α-amylase VrD1 trung gian làm cơ sở cho hoạt tính kháng mọt của defensin này.
Chen và cs (2002) đã phân lập gen defensin liên quan đến hoạt động của côn trùng. Tác giả đã phân lập được cDNA giàu protein cysteine (VrCRP). VrCRP được phân lập từ đậu xanh kháng mọt đục hạt. VrCRP mã hóa protein dài 73 amino acid, gồm 27 amino acid peptide tín hiệu, có chứa 8 cysteine. Dựa vào đặc điểm tương đồng và bảo thủ của các gốc ở các amino acid,người ta cho rằng VrCRP là một thành viên của họ defensin thực vật. VrCRP-TSP đã gây chết ấu trùng Callosobruchus bruchid (gây mọt đậu xanh). VrCRP là b o c o đầu tiên về defensin thực hoạt động chống côn trùng Callosobruchus chinensis [19].
Chen và cs (2004) đã nhân bản và biểu hiện chức năng của defensin1 đậu xanh VrD1 vào nấm men. cDNA của gen defensin phân lập từ đậu xanh đã được biểu hiện trong Pichia pastoris và tạo được defensin tái tổ hợp (rVrD1). VrD1 tái tổ hợp đã biểu hiện ức chế sự phát triển của nấm nhờ Fusarium oxysporum, Pyricularia oryza, Rhizoctonia solani, Trichophyton rubrum và ấu trùng mọt. Loại protein này cũng ức chế tổng hợp protein trong điều kiện invitro. Các hoạt tính sinh học đó tương tự như defensin biểu hiện ở vi khuẩn. Biểu hiện chức năng của VrD1 ở Pichia pastoris đã cung cấp một hệ thống có tính hữu dụng cao trong nghiên cứu quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của VrD1 sử dụng phương ph p ph t sinh đột biến [18].
Loại defensin đậu xanh VrD1 tái tổ hợp đã được chứng minh có hoạt tính kháng nấm và kháng mọt. Để nghiên cứu chức năng và sự điều hòa của VrD1, dẫn theo Chen và cs (2005) đã phân lập DNA hệ gen của defensin thực vật từ
Vigna radiata VC6089A và đậu đỏ Vigna angularis. DNA của defensin đậu đỏ VaD1 được giải trình tự và dịch mã ngược thành cDNA VaD1. Defensin VaD1 tinh sạch từ Vigna angulari tương đối đồng nhất. Trình tự amino acid hoàn chỉnh của VaD1 tinh sạch được x c định và hoàn toàn giống với trình tự suy diễn từ cDNA VaD1 [17].
VaD1 là protein cơ bản gồm 46 amino acid với bốn cầu nồi disulfide và có độ tương đồng cao với VrD1 (78.3%). VaD1 có khả năng ức chế sự phát triển của Fusarium oxysporum, Fusarium oxysporum f. sp. pisi, Staphylococcus epidermidis và Salmonella typhimurium. VaD1 cũng hạn chế quá trình tổng hợp in vitro protein và sự phát triển của ấu trùng mọt, nhưng có hoạt tính kém hơn VrD1 t i tổ hợp [18].
Nghiên cứu của Liu và cs (2006) đã nêu rõ vai trò của defensin ở đậu xanh trong hoạt động chống côn trùng, chống mọt. Defensin của đậu xanh (VrD1) là gen liên quan đến hoạt động của côn trùng. Trong số các các defensin thực vật được biết đến, VrD1 là gen đầu tiên mã hóa chuỗi peptide gồm 310 amino acid. Glu26 được bảo tồn cao giữa các defensins; VrD1 chứa
arginine, có thể tạo ra sự thay đổi trong định hướng của Trp10, qua đó thúc đẩy sự hình thành của protein VrD1. Hơn nữa, VrD1 ức chế hoạt động của α- amylase. α-amylase có vai trò quan trọng trong tiêu hóa tinh bột thực vật trong ruột côn trùng và biểu hiện ở hạt. VrD1 hoạt động ức chế hydrolase polysaccharide. Đã có nghiên cứu so sánh cấu trúc giữa hai nhóm các defensins thực vật có đặc trưng kh c nhau đối với α-amylase ở côn trùng cho thấy sự khác nhau giữa β2 β3 là c c vị trí liên kết có ảnh hưởng đến α- amylase. Nghiên cứu tương t c VrD1-α-amylase đã cung cấp thông tin có thể được sử dụng để cải thiện hoạt động của côn trùng từ VrD1. Cơ chế gây độc đối với các loại nấm của protein này vẫn chưa rõ nhưng defensin đã được chứng tỏ là làm tăng vận chuyển ion K+
ra ngoài màng, tăng hấp thụ Ca2+ của nấm
Neurosporao crassa. Chất defensin Dm-AMD1 của cây thược dược có thể tương t c đặc hiệu với Sphingolipid của nấm men [25]. Cơ chế gây độc của defensin đối với côn trùng gây mọt ở hạt đậu xanh là khi côn trùng phá huỷ những hạt đậu xanh thì defensin đã ngăn chặn sự tiêu hoá của tinh bột khi côn trùng ăn phải những hạt đó và ức chế sự sinh trưởng phát triển của chúng. Những thực vật cung cấp đủ defensin thì sẽ giết chết ấu trùng. Bởi vậy, cơ chế t c động của defensin như là một sự cản trở men phân giải tinh bột làm cho ấu trùng không thể tồn tại được.
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu 2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
Sử dụng một số giống đậu xanh do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm Việt Nam cung cấp làm vật liệu nghiên cứu. Các giống đậu xanh được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Danh sách các giống đậu xanh nghiên cứu
STT Tên giống Kí hiệu giống
1 Đậu Tằm DT 2 Đậu xanh 14 DX14 3 Đậu xanh 16 DX16 4 Đậu xanh 17 DX17 5 Đậu xanh 2 DX2 6 Đậu xanh 22 DX22 7 Đậu xanh V123 DX123
8 Đậu xanh Việt Nam 5 DX5
9 Đậu xanh Việt Nam 6 DX6
10 Đậu xanh Việt Nam 7 DX7
2.1.2. Hóa chất, thiết bị
Vector tách dòng pBT, chủng vi khuẩn E.coli DH5α do phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Thang DNA 1kb (GeneShun Biotech), Trizol reagents KIT (Invitrogen), Kit tổng hợp cDNA và RT-PCR (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit) (Thermo Scientific), Kit tách chiết plasmid (Plasmid Miniprep Kit) (QIAGEN),
Kit tinh sạch DNA (QIAGEN), các hóa chất thông dụng khác (cồn, agarose, X- gal, ampicilin, EDTA, enzyme…) của các hãng Merck, Sigma, GeneShun Bioteck, Invitrogen, Fermentas.
Các thiết bị sử dụng trong đề tài gồm: Máy quang phổ UV - Visible Spectrometer (Cintra 40) của Australia; máy li tâm lạnh Heraeus của Đức; máy PCR - PTC100 (MJ Research) của Mĩ; m y lọc nước dedion (Hàn Quốc); tủ ấm (Hàn Quốc); m y điện di và bộ nguồn Power Pae 300 (Bio Rad) của Mĩ; pipet các loại (Gilson, Pháp); tủ sấy của Anh; cân điện tử của Thụy Sỹ; tủ lạnh âm 300C (Sanyo, Nhật Bản); nồi khử trùng (Tomy, Nhật Bản); m y voltex (Đức)…
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ gen thuộc Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
Trình tự nucleotide của gen được x c định tại Viện công nghệ Sinh học.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Đánh giá khả năng kháng mọt của các giống đậu xanh
Cân 30g mẫu hạt đậu xanh cho vào lọ nhựa, mỗi lọ thả 10 cặp mọt trưởng thành. Theo dõi hạt bị mọt hại sau 20 ngày, 25 ngày, 30 ngày, 35 ngày. Dùng kính lúp để tìm hạt bị hại (hạt có lỗ thủng bên ngoài). Đếm và cân số hạt bị hại rồi tính tỷ lệ số lượng hạt bị hại và tỷ lệ khối lượng hạt bị hại do mọt theo các công thức sau:
Tỷ lệ số lượng hạt bị hại (%) = 100 × Số hạt kiểm traSố hạt bị hại
Tỷ lệ khối lượng hạt bị hại (%) = 100 × Khối lượng mẫu kiểm traKhối lượng hạt bi hại [6]
2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Hạt đậu xanh được xử lý bởi abscisic acid (ABA) để cảm ứng hoạt động của gen defensin 1 (DEF1) theo phương ph p Wang và cs (2002). ABA pha trong ethanol với nồng độ 1g/1ml, sau đó pha loãng 1 %, ngâm hạt trong ABA 8h rồi rửa lại bằng nước. Ủ ấm ở 380C trong 3 ngày rồi lấy mầm tách RNA tổng số. Các dụng cụ sử dụng trong t ch RNA đều đươc khử DEPC 0,01%.
Chúng tôi tiến hành tách chiết mRNA tổng số được thực hiện với Trizol reagents KIT (Invitrogen) theo c c bước cơ bản sau:
1.Nghiền nhanh 100mg mẫu trong nitơ lỏng thành bột mịn. 2.Thêm 1ml Trizol Regents, đảo nhẹ 5 phút.
3.Thêm 200µl C:I (24 cloroform: 1 isoamyl), đảo đều 5 phút.
4.Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, thu 500µl dịch nổi cho vào ống eppendort 1,5ml.
5.Bổ sung 500µl isopropanol 40C vào ống, đảo đều 15 phút ở 250C, để ở tủ -200C trong vòng 30 phút.
6.Ly tâm 12000 vòng trong 15 phút ở 40C, thu cặn, làm khô tủa.
7.Bổ sung 500µl cồn 70% (cồn pha trong DEPC), ly tâm 7000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa. Bước này lặp lại hai lần.
8.Làm khô RNA bằng mở nắp ống eppendort trong box vô trùng.
9. Bổ sung 50µl H2O, ủ ở nhiệt độ 550C trong 15 phút cho tan RNA, voltex.
2.2.2.2. Tổng hợp cDNA từ mRNA
Tổng hợp cDNA được tiến hành theo quy trình bằng bộ kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific):
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA
STT Thành phần Số lƣợng
1 H2O (DEPC) 5 µl
2 Mồi OligoT 1 µl
3 RNA khuôn 6 µl
4 Đảo đều nhẹ nhàng, ủ ở 65C trong 5 phút. Sau đó để vào đ . Bổ sung:
5 5X Reaction Buffer 4 µl
6 RiboLock RNase Inhibitor (20 u/µl) 1 µl
7 dNTP 10mM 2 µl
8 RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (200 u/µl) 1 µl
Ủ 25C trong 5 phút, 42C trong 60 phút, 70 C trong 5 phút, bước cuối ủ ở 4C.
Mẫu RNA thu được bảo quản trong tủ -840C.
2.2.2.3. Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật RT – PCR