STT Tên giống Kí hiệu giống
1 Đậu Tằm DT 2 Đậu xanh 14 DX14 3 Đậu xanh 16 DX16 4 Đậu xanh 17 DX17 5 Đậu xanh 2 DX2 6 Đậu xanh 22 DX22 7 Đậu xanh V123 DX123
8 Đậu xanh Việt Nam 5 DX5
9 Đậu xanh Việt Nam 6 DX6
10 Đậu xanh Việt Nam 7 DX7
2.1.2. Hóa chất, thiết bị
Vector tách dòng pBT, chủng vi khuẩn E.coli DH5α do phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Thang DNA 1kb (GeneShun Biotech), Trizol reagents KIT (Invitrogen), Kit tổng hợp cDNA và RT-PCR (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit) (Thermo Scientific), Kit tách chiết plasmid (Plasmid Miniprep Kit) (QIAGEN),
Kit tinh sạch DNA (QIAGEN), các hóa chất thông dụng khác (cồn, agarose, X- gal, ampicilin, EDTA, enzyme…) của các hãng Merck, Sigma, GeneShun Bioteck, Invitrogen, Fermentas.
Các thiết bị sử dụng trong đề tài gồm: Máy quang phổ UV - Visible Spectrometer (Cintra 40) của Australia; máy li tâm lạnh Heraeus của Đức; máy PCR - PTC100 (MJ Research) của Mĩ; m y lọc nước dedion (Hàn Quốc); tủ ấm (Hàn Quốc); m y điện di và bộ nguồn Power Pae 300 (Bio Rad) của Mĩ; pipet các loại (Gilson, Pháp); tủ sấy của Anh; cân điện tử của Thụy Sỹ; tủ lạnh âm 300C (Sanyo, Nhật Bản); nồi khử trùng (Tomy, Nhật Bản); m y voltex (Đức)…
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ gen thuộc Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
Trình tự nucleotide của gen được x c định tại Viện công nghệ Sinh học.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Đánh giá khả năng kháng mọt của các giống đậu xanh
Cân 30g mẫu hạt đậu xanh cho vào lọ nhựa, mỗi lọ thả 10 cặp mọt trưởng thành. Theo dõi hạt bị mọt hại sau 20 ngày, 25 ngày, 30 ngày, 35 ngày. Dùng kính lúp để tìm hạt bị hại (hạt có lỗ thủng bên ngoài). Đếm và cân số hạt bị hại rồi tính tỷ lệ số lượng hạt bị hại và tỷ lệ khối lượng hạt bị hại do mọt theo các công thức sau:
Tỷ lệ số lượng hạt bị hại (%) = 100 × Số hạt kiểm traSố hạt bị hại
Tỷ lệ khối lượng hạt bị hại (%) = 100 × Khối lượng mẫu kiểm traKhối lượng hạt bi hại [6]
2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Hạt đậu xanh được xử lý bởi abscisic acid (ABA) để cảm ứng hoạt động của gen defensin 1 (DEF1) theo phương ph p Wang và cs (2002). ABA pha trong ethanol với nồng độ 1g/1ml, sau đó pha loãng 1 %, ngâm hạt trong ABA 8h rồi rửa lại bằng nước. Ủ ấm ở 380C trong 3 ngày rồi lấy mầm tách RNA tổng số. Các dụng cụ sử dụng trong t ch RNA đều đươc khử DEPC 0,01%.
Chúng tôi tiến hành tách chiết mRNA tổng số được thực hiện với Trizol reagents KIT (Invitrogen) theo c c bước cơ bản sau:
1.Nghiền nhanh 100mg mẫu trong nitơ lỏng thành bột mịn. 2.Thêm 1ml Trizol Regents, đảo nhẹ 5 phút.
3.Thêm 200µl C:I (24 cloroform: 1 isoamyl), đảo đều 5 phút.
4.Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, thu 500µl dịch nổi cho vào ống eppendort 1,5ml.
5.Bổ sung 500µl isopropanol 40C vào ống, đảo đều 15 phút ở 250C, để ở tủ -200C trong vòng 30 phút.
6.Ly tâm 12000 vòng trong 15 phút ở 40C, thu cặn, làm khô tủa.
7.Bổ sung 500µl cồn 70% (cồn pha trong DEPC), ly tâm 7000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa. Bước này lặp lại hai lần.
8.Làm khô RNA bằng mở nắp ống eppendort trong box vô trùng.
9. Bổ sung 50µl H2O, ủ ở nhiệt độ 550C trong 15 phút cho tan RNA, voltex.
2.2.2.2. Tổng hợp cDNA từ mRNA
Tổng hợp cDNA được tiến hành theo quy trình bằng bộ kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific):