STT Thành phần Thể tích (μl) 1 Vector pBT (150ng/ µl) 1 2 Buffer T4 ligase (10 X) 1 3 T4 ligase (2 unit/µl) 1 4 DNA đã tinh sạch 5 5 H2O 2 Tổng 10
Hỗn hợp được ủ ở 220C trong 3 giờ, sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli chủng DH5α.
Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli chủng DH5α.
Sau khi thực hiện phản ứng nối gen quan tâm vào vector pBT, tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli chủng DH5α bằng phương ph p sốc nhiệt. Quy trình thực hiện như sau:
1.Tế bào khả biến được lấy từ tủ -800C và được để trong đ 10 phút. 2.Lấy 5µl plasmid tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến, trộn nhẹ. Đặt hỗn hợp trên đ 30 phút.
3. Sốc nhiệt ở 420C trong vòng 90 giây và chuyển ngay vào đ lạnh trong 10 phút.
4. Bổ sung 300 µl LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl, nước) nuôi lắc 200 vòng/phút ở 370C trong 1 giờ.
5. Lấy ra cấy trải trên môi trường LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl và agar) có thêm kháng sinh carbenicillin (100 mg/l), IPTG (0,1 mM) và X-gal (40 mg/l).
6. Ủ đĩa LB đặc được cấy trải ở 370C trong 16 giờ.
Sau đó, chọn khuẩn lạc có màu trắng nuôi trong môi trường LB lỏng (có bổ sung carbenicillin 1000 mg/l), ở 370C qua đêm. Kiểm tra thu khuẩn đục, bảo quản ở 40C.
Phƣơng pháp kiểm tra sản phẩm chọn dòng (colony-PCR)
Lấy dịch nuôi chứa vi khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng colony-PCR với cặp mồi của gen DEF1 đặc hiệu.
Hút 10μl dịch đục cho vào ống PCR. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút, thu cặn. Hòa cặn với 8-10μl nước khử ion. Chạy PCR và kiểm tra.
Thành phần của phản ứng colony-PCR tương tự như trong phản ứng PCR chỉ khác mẫu DNA thay bằng DNA plasmid. Chu trình nhiệt của phản ứng colony-PCR tương tự như trong phản ứng PCR. Sản phẩm colony-PCR
được kiểm tra trên gel agarose 1,2% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới nh s ng đèn cực tím.
Tách chiết plasmid tái tổ hợp
Sau khi kiểm tra sản phẩm colony- PCR tiến hành tách plasmid theo qui trình hướng dẫn của bộ Kit Plasmid Miniprep Kit của hãng Qiagen. Quá trình tách chiết plasmid tái tổ hợp gồm c c bước sau:
1.Lấy 1,5 ml dịch khuẩn, ly tâm 7000 vòng/phút trong 5 phút, 40C loại bỏ dịch nổi, thu cặn.
2.Bổ sung 100μl dung dịch Sol 1 (lạnh), sau đó lắc nhẹ.
3.Bổ sung 200μl dung dịch Sol 2, đảo nhẹ và để trên đ trong 10 phút. 4.Bổ sung 150μl dung dịch Sol 3 (lạnh), đảo nhẹ để trên đ trong 10 phút. 5.Sau đó bổ sung 450 - 500μl dung dịch Chloroform : isoamyl (24:1), đảo nhẹ và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút.
6.Thu dịch nổi và bổ sung thể tích tương đương isopropanol (1:1) để trong đ -200
C trong 20 phút.
7. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại dịch nổi.
8. Rửa tủa 2 lần với ethanol 70%, ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút mỗi lần là 500μl.
9. Loại bỏ dịch, thu cặn, làm khô và cho 40μl H2O có bổ sung RNase, ủ ở 37o
C trong 1 giờ.
Kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 1,2% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới nh s ng đèn cực tím.
2.2.3. Phương pháp xác định trình tự nucleotide
Trình tự nucleotide của gen DEF1 được x c định trên m y đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencingtại Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
So sánh trình tự nucleotide của gen và trình tự amino acid của protein bằng phần mềm BioEdit và DNAstar.
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu của đề tài được xử lý thống kê bằng chương trình excel theo Chu Hoàng Mậu (2008), x c định giá trị trung bình, phương sai, độ lệch chuẩn, sai số trung bình mẫu… [11].
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc điểm của các giống đậu xanh nghiên cứu
Hình thái và khối lượng hạt là một trong những đặc tính quan trọng được quan tâm trong công tác chọn tạo giống đậu xanh.
Kết quả phân tích đặc điểm hình thái các giống địa phương theo màu sắc hạt, hình dạng hạt, được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1.