%
Tỷ lệ khối lượng hạt bị mọt qua bốn thời điểm theo dõi của các giống đậu xanh nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra một số nhận xét sau:
Sau 20 ngày đầu các giống đậu xanh đều đã bị mọt ăn, ăn mạnh nhất vẫn là giống đậu xanh DX22 (20,00%), ăn ít nhất là giống đậu xanh DX123 (3,46%).
Sau 25 ngày các giống đều bị ăn mạnh, mạnh nhất vẫn là giống DX22 và bị ăn ít nhất vẫn là giống DX123. Sau 35 ngày các giống đều bị ăn trên 50%, trong đó giống DX22 bị ăn nhiều nhất gấp 1,73 lần so với giống DX123. Sự sắp xếp các giống đậu xanh nghiên cứu theo thứ tự giảm dần tỷ lệ khối lượng hạt bị hại của các giống đậu xanh như sau: DX22 > DX5 > DX16 > DX6 > DX2 > DX7 > DX17 > DX14 > DT > DX123.
Ở cả 2 phương ph p đ nh gi kh ng mọt trên, chúng tôi thấy rằng, thứ tự xếp hạng về khả năng kh ng mọt của các giống đậu xanh giống nhau ở cả 2 phương ph p nghiên cứu và tỷ lệ thiệt hại của các giống đậu xanh nghiên cứu cũng tương đương nhau. Cụ thể là, tỷ lệ thiệt hại của các giống đậu xanh nghiên cứu dần từ ngày nhiễm mọt thứ 20 đến 35 và cả 10 giống nghiên cứu đều bị thiệt hại trên 50%.
Từ các kết quả trên, có thể chia 10 giống đậu xanh nghiên cứu thành ba nhóm theo mức độ kháng mọt khác nhau. Nhóm có khả năng kh ng mọt kém nhất gồm các giống DX22, DX5, DX16 và DX6. Nhóm có khả năng kh ng mọt trung bình gồm các giống DX2, DX7 và DX17. Nhóm có khả năng kh ng mọt tốt nhất gồm các giống DX14, DT và DX123.
Trong 2 phương ph p trên chúng tôi thấy, phương ph p đ nh gi theo tỷ lệ số lượng hạt bị mọt hại chính xác và dễ thực hiện hơn phương ph p đ nh gi tỷ lệ khối lượng hạt bị hại. Vì vây, khi tiến hành đ nh gi khả năng kh ng mọt của hạt đậu đỗ chỉ cần thực hiên theo một phương ph p là dựa trên tỷ lệ số lượng hạt bị hại.
3.3. Kết quả phân lập gen defensin1 từ đậu xanh
3.3.1. Kết quả nhân gen defensin1 từ đậu xanh
Chúng tôi nhân gen DEF1 từ cDNA của đậu xanh. Vì vậy, chúng tôi tiến hành tách RNA của 2 giống đậu xanh DX16 và DX123.
RNA tổng số là một trong những vật liệu khởi đầu của những nghiên cứu ở cấp độ phân tử. Chất lượng của RNA tổng số có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của các thí nghiệm. Do RNA là đại phân tử không bền, dễ bị phân hủy bởi c c ribonuclease (RNase). Hơn nữa các RNase lại có mặt ở khắp nơi trong tế bào, có hoạt tính mạnh và rất bền. Vì thế, việc tách chiết RNA đòi hỏi phải thao tác thật cẩn thận để tránh mọi tạp nhiễm chứa RNase từ môi trường, tất các các dụng cụ đều phải được xử lý DEPC 0,01%. Và xử lý nhiệt trước khi tiến hành thí nghiệm: cối chày sứ được xử lý hấp khử trùng ở 1210C trong 3 giờ cùng với các dụng cụ như ống eppendorf, đầu côn,.. để loại trừ RNase.
Trong quá trình tách chiết, việc nghiền mẫu trong nito lỏng để phá vỡ thành tế bào và giải phóng các thành phần trong tế bào đòi hỏi thao tác phải nhanh. Các thành phần bổ sung như phenol, chloroform:isoamyl nhanh chóng biến tính protein, polysaccharide có trong hỗn hợp, giúp tách pha tốt sau quá trình ly tâm. Sản phẩm RNA tổng số được hòa tan trong DEPC 0,01% có tác dụng ngăn cản quá trình RNase thủy phân RNA.
Hạt của giống đậu xanh DX16 và DX123 được xử lý bởi abscisic acid (ABA) để cảm ứng hoạt động của gen DEF1. Hạt đậu xanh đã được xử lý cho nảy mầm và sử dụng mầm đậu xanh 3 ngày tuổi để làm nguyên liệu tách RNA tổng số. Quy trình tách RNA tổng số được thực hiện với Trizol reagents (Invitrogen).
Sau khi tách RNA tổng số, chúng tôi nhận thấy mẫu RNA tổng số đảm bảo cho việc tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Từ RNA tổng số, bằng phản ứng phiên mã ngược tạo cDNA để tiến hành phản ứng RT - PCR nhân gen DEF1.
Để x c định điều kiện tối ưu của phản ứng PCR trong quá trình thí nghiệm chúng tôi đã tính to n nhiệt độ bắt mồi là 58C và tiến hành phản ứng RT - PCR gồm có 35 chu kì. Kết quả nhân gen được kiểm tra bằng phương ph p điện di trên gel agarose 1,2% trong TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng của tia cực tím. Hình ảnh điện di được thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân cDNA DEF1 từ giống đậu xanh DX123 và DX16
1- DX123; 2- DX16; M: Marker DNA 1kb Plus (Fermentas)
Qua hình 3.4 cho thấy, ở giống đậu xanh nghiên cứu DX123 và DX16 xuất hiện băng DNA sang rõ duy nhất có kích thước khoảng 0,22kb, độ dài đoạn của DNA vừa nhận được phù hợp với tính toán lý thuyết khi thiết kế mồi dựa trên trình tự nucleotide đoạn mã hóa của gen DEF1 mang mã số AY437639 trên Ngân hàng gen Quốc tế.
Tuy nhiên, gen vừa nhân lên có đúng là gen DEF1 hay không và độ tương đồng như thế nào với trình tự gen DEF1 được công bố trên ngân hàng gen quốc tế là vấn đề đặt ra cho các phân tích tiếp theo.
Để phản ứng ghép nối đạt được hiệu quả cao nhất cần thiết phải có quá trình tinh sạch sản phẩm PCR để loại bỏ các thành phần không mong muốn. Qui trình tinh sạch sản phẩm PCR được thực hiện theo hướng dẫn của bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas. Trong bộ kit, trên cột thôi gel có màng chứa các phân tử ái lực cao với DNA, khi cho dịch có chứa DNA qua cột, DNA sẽ được giữ lại trên màng, các thành phần khác sẽ đi qua màng và được loại bỏ. Khi bổ sung nước vào màng, DNA được hòa tan và thu lại vào ống mới bằng cách ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút.
3.3.2. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli
Sản phẩm PCR tinh sạch được bảo quản và gắn vào vector tách dòng pBT để tạo vector tái tổ hợp có mang gen DEF1 mong muốn (pBT- DEF1). Hỗn hợp được ủ ở 22o
C trong 3 giờ với sự xúc tác của T4 ligase cho phản ứng xảy ra hoàn toàn. Vector tái tổ hợp pBT- DEF1 được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli
chủng DH5α bằng cách sốc nhiệt ở 42 oC trong 1 phút 30 giây. Chọn lọc các khuẩn lạc mong muốn dựa vào kiểu hình khi nuôi E.coli trên môi trường LB đặc (pepton, cao nấm mem, NaCl, agarose) có bổ sung carbenicilin (100mg/l), X-gal (40mg/l) và IPTG (100µM). Sự có mặt của DNA tái tổ hợp được kiểm tra bằng phản ứng colony - PCR và hình thái của các khuẩn lạc thu được.
Hiệu suất biến nạp phụ thuộc vào 2 yếu tố đó là tế bào khả biến phải đảm bảo tốt và c c bước tiến hành biến nạp phải tuân thủ nghiêm ngặt thời gian sốc nhiệt, thời gian giữ trong đ , đảm bảo kĩ thuật.
Khi đã thu được một số lượng lớn các khuẩn lạc xanh trắng trên môi trường LB đặc. Các dòng khuẩn lạc này đều mang vector có chứa gen kháng kháng sinh, vì vậy có thể mọc trên môi trường LB đặc chọn lọc. Thấy xuất hiện khuẩn lạc màu xanh là do không có đoạn gen ngoại lai chèn vào vector mà vector tự đóng vòng, hình thành cấu trúc gen lacZ hoàn chỉnh, hoạt động bình thường. Gen lacZ mã hóa β-galactosidase của vi khuẩn E.coli. Trên môi trường LB có chất cảm ứng IPTG,
enzyme β-galactosidase được tổng hợp, sẽ chuyển hóa cơ chất X-gal từ không màu thành màu xanh lam nên khuẩn lạc có màu xanh.
Nếu như đoạn cài DNA được chèn vào giữa gen lacZ tạo vector tái tổ hợp, làm gen lacZ mất hoạt tính, vùng promoter của gen lacZ không thể điều khiển gen cấu trúc phiên mã, đồng thời không thể dịch mã enzyme β- galactosidase chuyển hóa cơ chất X-gal nên lạc khuẩn có màu trắng.
Tuy nhiên, không phải tất cả các khuẩn lạc trắng thu được ở thí nghiệm đều mang vector tái tổ hợp có chứa đoạn gen qui định trình tự gen DEF1 mà có thể chứa đoạn gen là sản phẩm phụ của phản ứng PCR, hoặc sự đột biến trên promoter lacZ, sự đứt gãy bazơ thymin đầu 3’ của vector cũng có thể làm cho khuẩn lạc có màu trắng. Do đó, cần thực hiện quá trình chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chứa đoạn DNA đúng kích thước quan tâm.
Các dòng khuẩn lạc sau khi được chọn lọc bằng phương ph p colony- PCR trực tiếp từ khuẩn lạc, được nuôi trong môi trường LB lỏng để tách chiết plasmid. Plasmid được kiểm tra trên gel agarose 1,2% trong TAE 1X cho thấy đảm bảo cho phản ứng giải trình tự nucleotide của cDNA.
3.3.3. Kết quả giải trình tự cDNA DEF1
Để x c định trình tự nucleotide của gen DEF1 đã t ch dòng, chúng tôi tiến hành x c định trình tự nucleotide của gen DEF1 bằng m y x c định trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analizer. Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm BioEdit. Trình tự cDNA DEF1 của đậu xanh DX16 có kích thước là 222 nucleotide.
Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự nucleotide của cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 với trình tự nucleotide của đoạn mã hóa gen DEF1
ở đậu xanh đã công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế mang mã số AY437639, kết quả được thể hiện ở hình 3.5.
Hình 3.5. So sánh trình tự nucleotide của cDNA DEF1 ở giống đậu xanh DX16 với trình tự gen trên Ngân hàng gen Quốc tế
Kết quả ở hình 3.5 cho thấy kích thước cDNA DEF1 của giống đậu xanh DX16 và trình tự mang mã số AY437639 đều là 222 bp. Khi so sánh trình tự cDNA DEF1 của giống đậu xanh DX16 cho thấy cDNA DEF1 của giống DX16 và AY437639 giống nhau 94,6%. Như vậy, chúng tôi đã khuếch đại, t ch dòng thành công và x c định được trình tự nucleotide của cDNA DEF1 từ giống đậu xanh DX16.
So sánh trình tự nucleotide của cDNA DEF1 phân lập từ giống đậuxanh DX16 x c định 12 vị trí nucleotide sai khác so với trình tự gen DEF1 của mẫu đậu xanh sử dụng thiết kế cặp mồi mang mã số AY437639 công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế (Bảng 3. 4).
Bảng 3.4. Sự sai khác về trình tự nucleotide của cDNA DEF1 của giống đậu xanh DX16 và trình tự có mã số AY437639 Vị trí
Mẫu 13 16 41 54 60 87 112 200 201 206 207 217
AY437639 A T T T G T G G C G C T
Bảng 3.4 cho thấy, tại vị trí nucleotide thứ 13 (cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 là G còn gen DEF1 công bố trên ngân hàng gen Quốc tế mã số AY437639 là A), ở vị trí số 16, 54 và 217 (trình tự cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 là A còn gen DEF1 có mã số AY437639 là T), vị trí nucleotide 41và 87 (trình tự cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 là C còn gen DEF1 có mã số AY437639 là T), vị trí nucleotide 60 (trình tự cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 là T còn gen DEF1 có mã số AY437639 là G), vị trí nucleotide 87 (trình tự cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 là C còn gen DEF1 có mã số AY437639 là T), vị trí nucleotide 112, 200 và 206 (trình tự cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 là C còn gen DEF1 có mã số AY437639 là G), vị trí nucleotide 201 (trình tự cDNA
DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 là A còn gen DEF1 công có mã số AY437639 là C) còn vị trí nucleotide 207 (trình tự cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 là G còn gen DEF1 có mã số AY437639 là C).
Khi phân tích trình tự gen, ngoài trình tự nucleotide người ta còn quan tâm đến đến trình tự amino acid suy diễn, vì phân tử protein là sản phẩm của gen. Sự sai khác về nucleotide của gen DEF1 có thể làm thay đổi hoặc không làm thay đổi về amino acid của protein. Chúng tôi sử dụng phần mềm DNAstar để tạo phân tử protein suy diễn. Kết quả so sánh trình tự amino acid trong protein của gen DEF1 ở giống đậu xanh DX16 với giống đậu xanh công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế với mã số AY437639 được thể hiện ở hình 3.6.
Hình 3.6. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein DEF1 của giống đậu xanh DX16 với trình tự mang mã số AY437639
Kết quả ở hình 3.6 cho thấy, trình tự amino acid suy diễn trong protein của gen DEF1 ở giống đậu xanh DX16 và AY437639 đều có 73 amino acid và có sự tương đồng là 91,78%. Tuy nhiên, hai trình tự này có sự khác nhau ở một vài vị trí amino acid, cụ thể là: DX16 khác với AY437639 ở vị trí amino acid thứ 6 (F → I), ở vị trí 14 (L → P), ở vị trí 38 (G → R), ở vị trí 68, 69 và ở 73 (C → S) (Bảng 3.5).
Bảng 3.5. Sự sai khác về trình tự amino acid suy diễn của protein DEF1 ở giống đậu xanh DX16 và trình tự mang mã số AY437639
Vị trí Mẫu 6 14 38 68 69 73 AY437639 F (Phenylalanine) L (Leucine) G (Glycine) C (Glycine) C (Glycine) C (Glycine) DX16 I (Isoleucine) P (Proline) R (Arginine) S (Serine) S (Serine) S (Serine)
3.4. Phân tích sự đa dạng về trình tự nucleotode và trình tự amino acid suy diễn của gen DEF1 diễn của gen DEF1
Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự nucleotide của cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh DX16 với 2 trình tự nucleotide của gen DEF1 đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế, trong 3 trình tự gen có hai trình tự của Việt Nam (VN6 và DX16) và một trình tự phân lập từ Trung Quốc (AY437639).
Sử dụng phần mềm DNAstar kết quả đã x c định được hệ số tương đồng và hệ số sai khác di truyền về gen DEF1 giữa các giống đậu xanh.
Bảng 3.6. Hệ số tƣơng đồng và sai khác di truyền giữa các trình tự cDNA DEF1 của 3 giống đậu xanh
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.6 cho thấy, trình tự nucleotide của giống DX16 có độ tương đồng với 2 giống đậu xanh trên ngân hàng gen Quốc tế như sau: Giống có mã số AY437639 hệ số tương đồng là 94,6%; giống có mã số VN6 hệ số tương đồng là 96,8%. Như vậy, hệ số tương đồng của các giống đậu xanh là rất cao. Ở mức độ nucleotide, hệ số sai khác giữa giống đậu xanh DX16 với giống AY437639 là 5,6 và với giống VN6 là 3,2.
Sơ đồ hình cây được thiết lập dựa trên trình tự nucleotide của gen DEF1
của 3 mẫu đậu xanh thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3. . Sơ đồ hình cây về mối quan hệ gi a 3 giống đậu xanh dựa trên trình tự nucleotide của gen 1
Hình 3.7 cho thấy, 3 giống đậu xanh được chia làm 2 nhóm chính với khoảng cách di truyền 2,2%. Nhóm I gồm 2 giống đậu xanh AY437639, VN6 và nhóm II là giống đậu xanh DX16.
Chúng tôi tiếp tục so sánh trình tự amino acid suy diễn đoạn gen DEF1 của 3 mẫu đậu xanh nghiên cứu nhằm x c định hệ số tương đồng, hệ số sai khác và khoảng cách di truyền giữa 3 giống đậu xanh. Kết quả x c định hệ số tương đồng và hệ số sai khác bằng phần mền DNAstar được thể hiện ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác giữa 3 giống đậu xanh dựa trên trình tự amino acid suy diễn từ trình tự gen DEF1 (%)
Kết quả cho thấy hệ số tương tương đồng về trình tự amino acid suy diễn đoạn gen DEF1 của 3 giống đậu xanh phân tích có biên độ dao động nhỏ (91,9% - 94,6%), còn hệ số sai kh c dao động từ 5,6% đến 8,6%.
Sự sai khác về trình tự nucleotide và trình tự amino acid ở trên là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trên nhiều giống đậu xanh hơn nữa và so sánh với nhóm kháng mọt tốt nhằm tìm kiếm sự thay đổi các vị trí nucleotide và trình tự amino acid của gen DEF1 của các giống đậu xanh. Đây là cơ sở cho việc chọn tạo các giống đậu xanh có khả năng kh ng mọt tốt.