Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 30 giây
30
3 Gắn mồi 58 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose có nồng độ 1,2% trong TAE1X, nhuộm gel trong Ethidium bromide trong 10 phút, rửa gel bằng nước, soi dưới nh s ng đèn cực tím và chụp ảnh.
2.2.2.4. Tinh sạch sản phẩm nhân gen DEF1
Sau khi nhân được gen DEF1, bước tiếp theo cần thu nhận gen ở dạng tinh sạch và không lẫn gel agarose. Vì vậy, cần phải tiến hành tinh sạch sản phẩm nhân gen DEF1.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas. Quy trình thực hiện gồm c c bước sau:
1. Điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 1,2% với sự có mặt của marker chuẩn và cắt lấy băng quan tâm, cho vào ống eppendorf 2ml.
2. Bổ sung Binding Buffer với gel đã cắt theo tỉ lệ 1:1, ủ trong bể ổn nhiệt ở 600C trong 10 phút cho gel tan hoàn toàn tạo dịch trong suốt.
3. Chuyển ống hỗn hợp sang ống thôi gel, ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút sau đó bỏ dịch đ y.
4. Bổ sung 500 µl Wash buffer, ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch.
5. Li tâm cột rỗng 12000 vòng/1phút, mở nắp để 5 phút ngoài nhiệt độ phòng.
6. Bổ sung 20 µl Elution Buffer vào giữa màng, chuyển sang ống 1,5 ml mới, để nhiệt độ phòng khoảng 5 phút, sau đó, ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút.
7. Bỏ cột lọc, thu dịch đ y bảo quản ở -200C.
Kiểm tra sản phẩm thu được bằng điện di trên gel agarose 1,2% trong TAE 1X với sự có mặt của maker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.
2.2.2.5. Tách dòng gen và xác định trình tự nucleotid của gen
T ch dòng gen được thực hiện theo mô tả của Sambrook và cộng sự (2001) [28], c c kĩ thuật gồm:
Ghép nối đoạn gen đã làm sạch vào vector tách dòng. Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch sẽ được gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT.
Hình 2.1. Sơ đồ vector pBT
Phản ứng ghép nối DNA được thực hiện nhờ sự tham gia của T4 ligase. T4 ligase có khả năng hình thành liên kết phospho nối 2 đoạn DNA. Thành phần phản ứng chi tiết được thể hiện trong bảng sau: