Môi trường chiết là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới hiệu suất của quá trình chiết. Các mẫu được tiến hành chiết ở các pH khác nhau sẽ cho hiệu suất chiết khác nhau. Do đặc điểm công thức cấu tạo có 2 nguyên tử H+ linh động của nhóm –OH và nhóm –COOH nên THC-COOH có các phản ứng hóa học đặc trưng của nguyên tử H+, có tính axit nên khoảng pH nghiên cứu để chiết xuất là pH axit. Để đánh giá độ thu hồi chất phân tích ở
0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 5 6 7 Hi ệu su ất thu hồi H (% )
pH khác nhau ta tiến hành xử lý mẫu chọn axit TCA vừa kết tủa protein vừa tạo môi trường pH chiết. Tương tự như khảo sát dung môi chiết, sau khi chọn được hệ dung môi tối ưu cho quá trình chiết thì ta tiến hành khảo sát môi trường chiết. Quá trình lấy mẫu huyết tương, mẫu chuẩn và nội chuẩn thêm vào cũng dùng thểtích như khảo sát dung môi.
Lấy 1 ml huyết tương trắng, thêm 10 μl dung dịch THC-COOH nồng độ 200 g/ml, thêm 1 ml dung dịch axit TCA ở pH khác nhau từ 1 đến 5. Sau đó tiến hành chiết các mẫu theo quy trình xử lý mẫu bằng hệ dung môi 9:1, thêm 10 μl dung dịch THC-COOH-d3 nồng độ 200 ng/ml vào dịch chiết. Làm khô hoàn toàn và hòa tan lại cặn bằng 20 μl dung môi. Tiến hành khảo sát trên thiết bị và so sánh trực tiếp với hỗn hợp chuẩn 100 ng/ml không xử lý. Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần và lấy kết quả trung bình. Độ thu hồi tại các giá trị pH khác nhau được tính như đã trình bày ở phần khảo sát dung môi [27].
Kết quả độ thu hồi tại các giá trị pH khác nhau bảng 3.3 và hình 3.4.
Bảng 3. 3. Độ thu hồi chất phân tích trong máu tại các pH khác nhau
pH STHC-COOH/ STHC-COOH- d3 Trung bình STHC-COOH/ STHC-COOH- d3 Trung bình so sánh Độ thu hồi (%) 1,0 0,185 0,359 51,5% 2,0 0,236 0,359 65,7% 3,0 0,233 0,359 64,9% 4,0 0,291 0,359 81,1% 5,0 0,267 0,359 74,4%
Hình 3.4. So sánh độ thu hồi tại các pH khác nhau
Trong kỹ thuật phân tích THC-COOH, có rất nhiều axit có thể dùng tạo môi trường pH để chiết, nhưng ở luận văn này chúng tôi tiến hành dùng axit TCA đểđạt 2 mục đích là vừa kết tủa protein vừa tạo môi trường pH. Vì mẫu máu trong thực tế giám định chỉ thu được lượng nhỏ nên dùng axit TCA để giảm việc kết tủa protein rồi tạo môi trường pH chiết để tránh mất mẫu khi qua nhiều bước xử lý mẫu. Kết quả thể hiện trong bảng 3.4 và hình 3.5 cho thấy độ thu hồi của chất phân tích tăng khi pH tăng từ 1 đến 4 và đạt cao nhất tại pH = 4, sau đó tăng tiếp pH đến 5 thì độ thu hồi của chất phân tích giảm xuống. Như vậy ở môi trường chiết pH = 4, độ thu hồi chất phân tích là cao nhất, đồng thời lượng tạp chất trên sắc đồcũng ít nhất cho thấy khảnăng chiết THC-COOH ở môi trường pH = 4 cho kết quả tốt nhất. Nhìn chung với pH axit sẽ cho phép tách THC-COOH ra khỏi mẫu máu đi vào pha dung môi hexanee, 10% ethylacetate giúp tạo ái lực và chuyển pha giữa phân cực sang không phân cực tốt hơn. Kết quả nghiên cứu này cũng tương đương kết quả phân tích hàm lượng THC-COOH trong móng tay của Kim và cộng sự [28, 29].
Vì vậy, lựa chọn dung dịch axit TCA ở pH = 4 làm môi trường chiết và để kết tủa prorein trong mẫu máu là tốt nhất.