Đối với phương pháp chiết lỏng - lỏng, dung môi đóng vai trò quan trọng trong việc tách chiết các chất phân tích ra khỏi hỗn hợp. Tiến hành lựa chọn dung môi chiết cần thỏa mãn các tiêu chí như sau: Dung môi không hòa tan trong nước, ít độc, dễ kiếm (tương đối thông dụng, thường dùng trong các phòng thí nghiệm phân tích), nhiệt độ sôi thấp (để dễ bay hơi khi đuổi dung môi ra khỏi dịch chiết), dễ phân tách khi chiết xuất. Ngoài ra có thể xem xét thêm các yếu tố như an toàn cháy nổ và khả năng gây kích ứng khi người phân tích tiếp xúc.
Dựa vào các tiêu chí về lựa chọn dung môi và qua nghiên cứu các tài liệu tham khảo, ở đề tài này chúng tôi tiến hành lựa chọn hai dung môi hexane/etylaxetat ở 6 tỉ lệ khác nhau để khảo sát khảnăng chiết THC-COOH. Tiến hành lấy 1 ml huyết tương trắng, thêm 10 μl dung dịch THC-COOH 200 ng/ml, dùng axit TCA vừa kết tủa protein vừa để điều chỉnh pH, thay đổi tỷ lệ dung môi gồm 100% hexanee và hỗn hợp hexanee/etylaxetate: 9:1, 8:2; 7:3; 6:4 và 5:5. Chiết các mẫu theo quy trình tại giá trị pH tối ưu 4, thêm 10 μl dung dịch THC-COOH-d3 nồng độ 200 ng/ml vào dịch chiết. Làm khô hoàn toàn và hòa tan lại cặn bằng 20 μl dung môi. Tiến hành khảo sát trên thiết bị và so sánh trực tiếp với hỗn hợp chuẩn 100 ng/ml không xử lý. Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần và lấy kết quả trung bình.
Trong thí nghiệm lấy 1 ml huyết tương vì trong thực tế giám định thì thường cơ quan trưng cầu gửi lượng máu không nhiều chỉ khoảng 3 ml đến
5 ml máu, lượng mẫu vừa để phân tích và vừa để lưu mẫu trong quá trình giám định cần kiểm tra lại. Căn cứ vào tài liệu tham khảo thì trong luận văn này chúng tôi tính lượng máu chiết 1 ml để tối ưu nhất với lượng máu thu được trong công tác giám định. Thêm 10μl dung dịch THC-COOH 200 ng/ml và 10 μl dung dịch THC-COOH-d3 nồng độ 200 ng/ml vào 1 ml huyết tương để đạt nồng độ THC-COOH và THC-COOH-d3 ở 100 ng/ml dùng quá trình khảo sát.
Đánh giá độ thu hồi bằng cách so sánh tỉ lệ diện tích peak của chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn được xử lý, chiết xuất và nội chuẩn thêm vào sau khi chiết với tỉ lệ diện tích peak của mẫu chuẩn và nội chuẩn không qua xử lý và chiếtxuất.
Kết quả độ thu hồi giữa các tỉ lệ dung môi được thể hiện trong bảng 3.2 và hình 3.3.
Bảng 3. 2. Độ thu hồi chất phân tích trong máu tại các tỉ lệ dung môi khác nhau
TT Dung môi STHC-COOH/ STHC-COOH- d3 Trung bình STHC-COOH/ STHC-COOH- d3 Trung bình So sánh Hiệu suất thu hồi (%) 1 hexanee 0,254 0,339 75,1% 2 hexanee/ETA (9:1, v/v) 0,281 0,339 82,8% 3 hexanee/ ETA (8:2, v/v) 0,256 0,339 75,5% 4 hexanee/ ETA (7:3, v/v) 0,232 0,339 69,6% 5 hexanee/ ETA (6:4, v/v) 0,227 0,339 66,9% 6 hexanee/ ETA (5:5, v/v) 0,186 0,339 55,5%
Hình 3.3. So sánh độ thu hồi tại tỉ lệ dung môi khác nhau
Kết quả thể hiện trong bảng 3.2 và hình 3.3 cho thấy độ thu hồi các chất phân tích tại tỉ lệ dung môi hexanee/etylaxetate: 9:1 (v/v) là tốt nhất, hexanee là dung môi không phân cực còn etylaxetate có độ phân cực thấp sẽ làm cho khả năng tách THC-COOH dễ nhất, đồng thời chúng là dung môi dễ mua, ít tốn kém, thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm phân tích ma túy tại các địa phương, ít độc hại hơn so với các dung môi khác. Phương pháp chiết lỏng – lỏng cũng đã được áp dụng nhiều trong các nghiên cứu trước đây, tỷ lệ dung môi tối ưu này đã được áp dụng để tách chiết THC và các dạng chuyển hóa của chúng trong mẫu máu cũng như mẫu nước tiểu [12].
Vì vậy, để tối ưu quá trình phân tích, hỗn hợp dung môi hexanee/etylaxetate (9:1, v/v) được lựa chọn để tách THC-COOH ra khỏi máu của đối tượng sử dụng cần sa.