Qua nghiên cứu xác định THC-COOH trong máu, một chất chuyển hóa của cần sa trong máu để khẳng định đối tượng sử dụng cần sa. Tuy trong luận văn còn nhiều điểm khiêm tốn nhưng đã có những đóng góp mới như sau:
- Lần đầu tiên phân tích chất chuyển hóa THC-COOH của cần sa trong máu bằng LC-MS/MS. Đề tài là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam phân tích một chất chuyển hóa THC-COOH của cần sa trong máu bằng LC-MS/MS không sử dụng tác nhân dẫn xuất. Đề tài đã xây dựng được quy trình phân
tích máu bằng cách sử dụng axit TCA để vừa kết tủa protein vừa dùng tạo môi trường pH chiết để giảm thiểu bước xử lý mẫu để tránh thao tác nhiều bước dẫn đến mất mẫu. Với phương pháp này, chất phân tích được thu hồi với hiệu suất cao (82,4%).
- Kết quả phân tích mẫu máu của 09 mẫu thực tế thu thập được trong quá trình giám định. Tuy lượng mẫu thực tế thu thập được không nhiều do đề tài thực hiện trong tình hình dịch bệnh phức tạp, việc các cơ quan trưng cầu ở các địa phương đến trưng cầu gặp nhiều khó khăn trong vấn đề đi lại nên hạn chế phần nào số lượng mẫu gửi đến cơ quan giám định. Thông qua các mẫu giám định thực tế đã đóng góp một phần trong công tác điều tra hình sự. Việc xây dựng thành công phương pháp xác định THC-COOH trong mẫu máu góp phần không nhỏ trong công cuộc đấu tranh phòng chống ma túy tại Việt Nam.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Luận văn đã hoàn thành các mục tiêu đề ra và thu được các kết quả như sau:
- Xác định các điều kiện LC-MS/MS để phân tích THC-COOH. Chất phân tích được tách bằng sắc ký lỏng với pha động theo gradient nhiệt độ, thể tích tiêm mẫu 2 µl, chế độ không chia dòng; phát hiện và định lượng bằng MS với nguồn ion hóa ESI (-), sử dụng kỹ thuật ghi phổ MRM.
- Xây dựng được quy trình xử lý mẫu máu, xây dựng được điều kiện chiết lỏng – lỏng THC-COOH trong mẫu máu với thể tích mẫu 1 ml máu, pH = 4 và hệ dung môi hexanee/etylaxetate (9/1), thể tích 3 ml.
- Đã thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu cao, có khả năng xác định chất THC-COOH tại hàm lượng thấp hơn 5 ng/ml; ảnh hưởng của nền mẫu nằm trong khoảng ± 15 % và giá trị RSD (%) nhỏ hơn 15%; có độ thu hồi từ 78,2% đến 82,4%.
- Xây dựng được đường chuẩn phân tích định lượng THC-COOH trong khoảng 5-400 ng/ml với hệ số tương quan r2 = 0,9976.
- Xác định được giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp đối với THC-COOH và THC-COOH-d3 là LOD= 3 ng/ml; LOQ = 4 ng/ml.
- Đánh giá được tính phù hợp của phương pháp với RSD ở hai điểm nồng độđầu và nồng độ cuối của đường chuẩn nhỏ (10,4% và 1,9%).
- Xây dựng được quy trình phân tích THC-COOH trong mẫu máu của người sử dụng cần sa.
- Ứng dụng phân tích trên một số mẫu máu nghi sử dụng cần sa với hàm lượng từ 23,79 ng/ml – 48,61 ng/ml tùy thuộc vào tiền sử sử dụng cần sa và thời gian tính từ thời điểm sử dụng lần cuối đến thời điểm lấy mẫu nước tiểu phân tích bao lâu.
- Kết quả của đề tài đã được chấp nhận đăng 01 bài báo trên Tạp chí Phân tích Hóa Lý và Sinh học vào tháng 12 năm 2021.
Kiến nghị
Cho đến nay, phân tích các chất ma túy trong dịch sinh học vẫn là vấn đề khó trong giám định ma túy nói chung. Tuy nhiên, việc phân tích chất chuyển hóa của cần sa này trong máu đang là xu hướng của các phòng giám định ma túy trên toàn thế giới. Để đảm bảo việc phân tích được khách quan, chính xác và thực hiện hiệu quả công tác phòng chống ma túy ở Việt Nam, chúng tôi có một số kiến nghị sau:
✓ Áp dụng phân tích chất THC-COOH trong máu tại một số cơ sở có đủđiều kiện ởđịa phương.
✓ Tiến hành kiểm tra đại trà các đối tượng nghi ngờ sử dụng ma túy tại các vũ trường, sàn nhảy và những người lái xe khi tham gia giao thông.
✓ Tiếp tục khảo sát sâu hơn về chiết mẫu từ trong máu đặc biệt là loại bỏ protein trong nền mẫu.
✓ Tiếp tục nghiên cứu phân tích các chất chuyển hóa của cần sa và các nhóm ma túy khác trong các loại mẫu khác nhau.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Coulter, C., M. Garnier, and C. Moore, 2012, Analysis of tetrahydrocannabinol and its metabolite, 11-nor-Δ⁹-tetrahydrocannabinol-9- carboxylic acid, in oral fluid using liquid chromatography with tandem mass spectrometry. J Anal Toxicol. 36(6): p. 413-7.
2. UNODC, 2009, Recommended Methods for the Identification and Analysis of Cannabis and Cannabis Products. New York: United Nations.
3. Huestis, M.A., J.E. Henningfield, and E.J. Cone, 1992, Blood cannabinoids. i. absorption of thc and formation of 11-oh-thc and thccooh during and after smoking marijuana. Journal of Analytical Toxicology. 16(5): p. 276-282.
4. Musshoff, F. and B. Madea, 2006, Review of biologic matrices (urine, blood, hair) as indicators of recent or ongoing cannabis use. Ther Drug Monit. 28(2): p. 155-63.
5. Stout, P.R., C.K. Horn, and K.L. Klette, 2001, Solid-phase extraction and GC-MS analysis of THC-COOH method optimized for a high-throughput forensic drug-testing laboratory. J Anal Toxicol. 25(7): p. 550-4.
6. Chu, M.H. and O.H. Drummer, 2002, Determination of delta9-THC in whole blood using gas chromatography-mass spectrometry. J Anal Toxicol. 26(8): p. 575-81.
7. Del Mar Ramirez Fernandez, M., et al., 2008, Simultaneous analysis of THC and its metabolites in blood using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 875(2): p. 465-70.
8. Chebbah, C., et al., 2010, Direct quantification of 11-nor-Delta(9)- tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid in urine by liquid chromatography/tandem mass spectrometry in relation to doping control analysis. Rapid Commun Mass Spectrom. 24(8): p. 1133-41.
9. Tully, A. Examination of Concentrations of THC and its Major Metabolites in Postmortem Blood Using Solid-Phase Extraction Preparation Methods and Analysis by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. 2018. University of Colorado Colorado Springs.
10. Spindle, T.R., et al., 2020, Pharmacokinetics of cannabis brownies: A controlled examination of Δ9-tetrahydrocanna-binol and metabolites in blood and oral fluid of healthy adult males and females. Journal of Analytical Toxicology. 44(7): p. 661-671.
11. Sears, R.M., Solid phase extraction of THC, THC-COOH and 11-OH- THC from whole blood, Agilent, Editor. 2010.
12. Han, E., et al., 2011, Simultaneous analysis of Δ(9)- tetrahydrocannabinol and 11-nor-9-carboxy-tetrahydrocannabinol in hair without different sample preparation and derivatization by gas
chromatography-tandem mass spectrometry. J Pharm Biomed Anal. 55(5): p. 1096-103.
13. Andrews, R.J., Analysis of cannabinoids in post-mortem blood and hair – its value in post-mortem toxicology. 2013, Imperial College London: London.
14. Ri, N.V., 2009, Các phương pháp tách. Hà nội: Đại học QGHN.
15. Stefanelli, F., et al., 2018, A novel fast method for aqueous derivatization of THC, OH-THC and THC-COOH in human whole blood and urine samples for routine forensic analyses. Biomed Chromatogr. 32(4).
16. Tuyến, N.T., 2015, Nghiên cứu quy trình giám định 11-nor-9-cacboxyl- delta-9-tetrahydrocannabinol trong nước tiểu của người bằng GC-MS, Luận văn thạc sĩ khoa học Hà nội: Đại học QGHN.
17. Trường, N.X., 2015, Phát hiện và giám định ma túy sinh học. Hà nội: Viện Khoa học hình sự.
18. Jamey, C., et al., 2008, Determination of cannabinoids in whole blood by UPLC-MS-MS. J Anal Toxicol. 32(5): p. 349-54.
19. Simões, S.S., A.C. Ajenjo, and M.J. Dias, 2011, Qualitative and quantitative analysis of THC, 11-hydroxy-THC and 11-nor-9-carboxy-THC in whole blood by ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 25(18): p. 2603-10.
20. Concheiro, M., et al., 2013, Simultaneous quantification of Δ9- tetrahydrocannabinol, 11-nor-9-carboxy-tetrahydrocannabinol, cannabidiol and cannabinol in oral fluid by microflow-liquid chromatography–high resolution mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1297: p. 123-130.
21. Al-Zahrani, M.A., et al., 2021, Quantification of cannabinoids in human hair using a modified derivatization procedure and liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Drug Testing and Analysis. 13(6): p. 1095-1107.
22. Stephanson, N., et al., 2008, Accurate identification and quantification of 11-nor-delta(9)-tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid in urine drug testing: evaluation of a direct high efficiency liquid chromatographic-mass spectrometric method. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871(1): p. 101-8.
23. Quintela, O., et al., 2007, A validated method for the detection of Delta 9-tetrahydrocannabinol and 11-nor-9-carboxy- Delta 9- tetrahydrocannabinol in oral fluid samples by liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. J Anal Toxicol. 31(3): p. 157-64.
24. Thảo, T.T., 2006, Bài giảng Thống kê trong Hóa phân tích. Hà nội: Đại học QGHN.
25. Chinh, P.Q., 2018, Nghiên cứu xác định vết một số ma túy tổng hợp nhóm kích thích thần kinh loại amphetamin và ketamin trong tóc và nước
tiểu bằng sắc ký khí khối phổ, Luận án tiến sĩ dược học. Hà nội: Đại học Dược Hà nội.
26. Phương, V.A., 2019, Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích Paraquat trong huyết tương và ứng dụng phục vụ chẩn đoán điều trị bệnh nhân ngộ độc cấp Paraquat, Luận án tiến sĩ hóa học. Hà nội: Đại học QGHN
27. Wohlfarth, A., N. Roth, and V. Auwärter, 2012, LC-MS/MS analysis of Δ9-tetrahydrocannabinolic acid A in serum after protein precipitation using an in-house synthesized deuterated internal standard. Journal of Mass Spectrometry. 47(6): p. 778-785.
28. Kim, J.Y., et al., 2008, Simultaneous determination of amphetamine- type stimulants and cannabinoids in fingernails by gas chromatography- mass spectrometry. Arch Pharm Res. 31(6): p. 805-13.
29. Lemos, N.P., R.A. Anderson, and J.R. Robertson, 1999, Nail Analysis for Drugs of Abuse: Extraction and Determination of Cannabis in Fingernails by RIA and GC-MS. Journal of Analytical Toxicology. 23(3): p. 147-152.
30. Vozella, V., et al., 2019, Fast and Sensitive Quantification of Δ9- Tetrahydrocannabinol and Its Main Oxidative Metabolites by Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry. Cannabis and Cannabinoid Research. 4(2): p. 110-123.
PHỤ LỤC
Hình 1. Sắc ký đồ và phổ khối của THC-COOH-d3 ở dung môi hexanee/ethylacetate (9/1)
Hình 2. Sắc ký đồ và phổ khối của THC-COOH, THC-COOH-d3ở pH =4 Hình 3. Sắc ký đồ và phổ khối của THC-COOH, THC-COOH-d3 của LOD và LOQ
Hình 4. Sắc ký đồ và phổ khối của THC-COOH, THC-COOH-d3 của 09 mẫu thực tế.
Sắc ký đồ và phổ khối của THC-COOH-d3ở dung môi hexanee/ethylacetate (9/1) lần 1
Sắc ký đồ và phổ khối của THC-COOH-d3ở dung môi hexanee/ethylacetate (9/1) lần 2
Sắc ký đồ và phổ khối của THC-COOH-d3ở dung môi hexanee/ethylacetate (9/1) lần 3
Sắc ký đồ và phổ khối của THC-COOH, THC-COOH-d3 09 mẫu thực tế Sắc ký đồi và phổ khối mẫu thực tế M1
PHỤ LỤC BÀI BÁO ĐƯỢC CHẤP NHẬN ĐĂNG TRÊN
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CẦN SA (11-NOR-9-CARBOXY-THC) TRONG MÁU TRÊN THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KÉP
(LC-MS/MS)
Ngày đến Tòa soạn: 20/10/2021
STUDY ON QUANTIFICATION OF CANNABINOIDS (11-NOR-9- CARBOXY-THC) IN HUMAN BLOOD BY USING
LIQUID CHROMATOGRAPHY-TENDEM MASS SPECTROMETRY (LC-MS/MS)
Đỗ Thị Hiếu, Phan Quang Thăng
Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
Phan Quang Thăng, Vương Trần Quang
Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
Đỗ Thị Hiếu, Hoàng Thế Thắng
Viện Khoa học hình sự, Bộ Công An
SUMMARY
The liquid-liquid extraction method combined with liquid chromatography–tandem mass spectrometry has been applied to analyze the concentrations of 11-nor-9-carboxy (THC-COOH) in human blood. This method allows the determination of THC-COOH in human blood with a small sample amount (1 ml of biosample) without derivatization of THC-COOH to volatile compounds as analyzed on a GC-MS/MS. Using the centrifugation technique with the solvent mixture ratio of hexane/ethylacetate (9:1, v/v) for the optimum condition, the extraction efficiency reached up to 82.8%. The optimum pH condition was 4. The analytical recovery of blood samples was 78 and 82% at the THC-COOH concentrations of 25 and 100 ng/ml, respectively. The linearity of the calibration curve for quantification ranged from 5 to 400 ng/ml with R2 = 0.997. The THC-COOH-free plasma samples were added to determine the influence of the sample matrix, and the results showed that the effect of the sample matrix at different concentrations from 5 to 100 ng/ml was less than 15%. After optimization of the pre-treatment and analytical conditions, a standard analytical procedure was proposed. This method was first investigated under laboratory conditions in Vietnam. Therefore, the analytical method developed in this study can be applied in other laboratory equiped with required instruments. Furthermore, this method also helps to reduce extraction time and analysis costs with high analytical accuracy and reliability, and to determine the usage dose of THC-COOH following a positive rapid test result for cannabis.
1. MỞ ĐẦU
Theo báo cáo về ma túy thế giới của Liên hợp quốc năm 2014 có tới 5,2% dân số thế giới ở độ tuổi từ
15-64 đã sử dụng trái phép chất ma túy. Trong số
đó, cần sa là một trong những loại ma túy được sử
dụng và tiêu thụ rộng rãi nhất [1]. Ma túy là những
chất có tác dụng làm thay đổi trạng thái tâm lý và sinh lý của người sử dụng, có khả năng bị lạm dụng và gây ra sự phụ thuộc về tâm, sinh lý vào việc sử dụng các chất đó. Khi ngừng dùng chất ma túy,
người nghiện thường không kiểm soát được hành vi
của mình, tìm mọi cách để có ma túy sử dụng tiếp, có khuynh hướng gia tăng liều lượng nhằm thỏa mãn trạng thái tinh thần, cảm giác mong muốn. Người sử dụng cần sa có thể bị rối loạn thần kinh, gây mất thăng bằng, chóng mặt, rối loạn tình dục,
làm giảmkhả năng sinh sản, làm trụy thai, chết thai
thậm chí gây rối loạn nhiễm sắc thể nếu sử dụng lâu dài. Từ cần sa người ta đã phân lập được khoảng 61 chất kích thích khác nhau, với thành phần chủ yếu
là THC (delta 9 –tetrahydrocannabinol), CBN (canabinol), CBD (cannabidiol). Trong đó THC là hoạt chất chính gây ra tác dụng tâm lý tới người sử dụng cần sa.
Trong khi xét nghiệm cần sa trong nước chưa thể cung cấp đầy đủ về lâm sàng và pháp y thì kết quả trong mẫu máu có thể trả lời về thời gian sử dụng cũng như quá trình chuyển hóa. Tuy nhiên với mẫu máu, việc xử lý mẫu trên nền mẫu nhiều protein và chất béo sẽ khó khăn hơn. Yêu cầu về giới hạn định
lượng trong mẫu máu cũng thấp hơn [2].
Có một vài phương pháp giúp xác định THC trong mẫu máu: 1) phương pháp sàng lọc ELISA: phương pháp này dựa trên cơ chế miễn dịch, và là phương pháp đầu tiên được áp dụng nhằm sàng lọc các đối tượng nghi ngờ sử dụng ma túy. Có thể áp dụng nhanh đối với lái xe, các đối tượng bị bắt giữ trong
các vụ án [3]; 2) THC cũng được phân tíchphổ biến
trên GCMS, tuy nhiên việc phân tích trên GC cần nhiều thời gian để tách chiết mẫu và yêu cầu kỹ thuật dẫn xuất hóa chuyển từ pha lỏng sang chất dễ
bay hơi cho pha khí [4, 5]; 3) Xác định THC bằng
LC-MS/MS cho phép xác định trực tiếp, phương
pháp có tính chọn lọc, độ nhạy cao và phù hợp với đối tượng phân tích lượng mẫu ít.
Trên thế giới đã có một số nghiên cứu phân tích
THC và các dạng chuyển hóa của nó trên thiết bị
sắc ký lỏng khối phổ, trong đó có thể kể đến như phân tích THC trong dịch miệng bằng kỹ thuật dòng
thấp trên LC-MS phân giải cao [6], khoảng tuyến