Để định lượng được THC-COOH trong mẫu máu, các yếu tố cơ bản của điều kiện phân tích như tìm mảnh phổ đặc trưng, mảnh phổ định lượng, thời gian lưu cùng các điều kiện phân tích trên máy như thế bắn phá cần phải được khảo sát. Bơm trực tiếp 200 μl chất chuẩn THC-COOH, cùng nội chuẩn THC-COOH-d3 có nồng độ 100 ng/ml vào buồng MS. Kết quả Phổ khối của MS cùng điều kiện phân tích được thể hiện trong bảng 3.1 dưới đây:
Bảng 3. 1. Các phân mảnh, thời gian lưu và thế bắn phá của THC-COOH và THC-COOH-d3 Chất phân tích Mảnh mẹ (Precursor ion) (m/z) Mảnh con (Production ionsẽ) (m/z) Thời gian lưu (phút) Thế bắn phá (V) THC-COOH-d3 346,5 302,2 248,1 194,1 3,390 15.0 25.0 28.0 THC-COOH 343,5 299,2 245,1 191,1 3,399 16.0 24.0 27.0 Một số công trình công bố trước đây khi khảo sát điều kiện phân tích THC-COOH trong máu, kết quả cho thấy THC-COOH có phân mảnh m/z= 343,5; 299,2; 245,1; 191,1 và THC-COOH-d3 có phân mảnh m/z= 346,5; 302,2; 248,1; 194,1 [15, 22]. Theo kết quả khảo sát thì cho kết quả phân mảnh của các chất phù hợp các nghiên cứu tham khảo. Với điều kiện phân mảnh như bảng trên, để chọn mảnh định lượng ta chọn mảnh cho peak lớn rõ ràng nhất trong các peak. Dựa vào các kết quảcơ chế phân mảnh của THC-COOH mặc dù mảnh 299,2 lớn nhất nhưng trong máu của người dùng cần sa vẫn còn tồn tại một lượng rất nhỏ THC chưa chuyển hóa, mà phân mảnh của THC có mảnh m/z=299,2 sẽ trùng với phân mảnh m/z của THC-COOH làm ảnh hưởng kết quả định lượng. Vì vậy, chọn mảnh 245,1 là mảnh định lượng của THC-COOH. Đối với THC-COOH chọn m/z = 302,2 làm mảnh phân tích
định lượng. Sắc đồ phân mảnh và kết quả tối ưu hóa phân mảnh này cũng tương tự như các công trình công bố trước đây
Hình 3. 1. Phân mảnh m/z của (a) THC-COOH (b) và TCH-COOH-d3
-Khảo sát pha động: Tiến hành khảo sát 3 hệpha động hệ 1, hệ 2 và hệ 3 dựa theo các nghiên cứu đã được tìm hiểu [22], để chọn hệ pha động có khả năng tách, thời gian lưu phù hợp và cho các peak cân đối thuận lợi cho phân tích định lượng. Chuẩn bị hỗn hợp chuẩn 100 ng/ml và nội chuẩn 100 ng/ml, Tiến hành khảo sát trên thiết bịở 3 hệ dung môi thay đổi nồng độ Amoniacetat 2 mM, 5 mM và 10 mM ở pha động A còn cố định pha động B: ACN và MeOH (85:15)
Kết quả được trình bày dựa trên sắc ký đồ thu được như sau:
Hình 3. 2. So sánh Peak THC-COOH ở 3 nồng độ Amoniacetat khác nhau (a) 2 mM, (b) 5 mM và (c) 10 mM
Như vậy, dựa vào sắc ký đồ trong 3 hệ dung môi thì mặc dù ở nồng độ 10 mM có cho diện tích peak cao nhưng không ổn định do ảnh hưởng nồng độ muối Amoniacetat ở nồng độ cao, mặc dù trong quá trình pha dung dịch
(a) (b) 299.2 245.1 191.1 302.1 248.1 194.1 (a) (b) (c)
muối đã lọc qua màng lọc nhưng trong quá trình tiến hành phân tích thì muối vẫn bị tạo kết tủa 1 phần dẫn đến khi chạy thì pha động không đạt đúng nồng độ 10 mM và ảnh hưởng đến quá trình tách của pha động và ảnh hưởng cột tách, nên diện tích peak lúc cao lúc thấp không ổn định như vậy ảnh hưởng đến kết quả định lượng chất phân tích. Mặt khác nếu quá trình tạo muối diễn ra trong thời gian dài sẽ đóng bám kết tủa vào cột thì sẽ làm hỏng cột. Như vậy dựa vào sắc ký đồ thì hệ dung môi 2 (5 mM) cho peak đặc trưng nét và ổn định, phổ khối của các mảnh phù hợp với cơ chế phân mảnh của THC- COOH, thời gian phân tích nhanh hơn còn hệ dung môi 1 (2 mM) khả năng tách kém cho peak không rõ ràng và thấp. Do vậy, lựa chọn hệ dung môi 2 và các điều kiện như trình bày chương 2 để phân tích.