1.4.2.1. Giới thiệu chung
Topoiosmerase-DNA là nhóm enzyme phổ biến nhất trong tất cả các vật thể sống từ virus tới con người, chịu trách nhiệm đóng và tháo xoắn phân tử DNA, tạo điều kiện cho các enzyme khác cùng phối hợp trong quá trình sao chép, nhân đôi, phiên mã và các quá trình khác trong hạt nhân [93]. Chúng thực hiện chức năng này bằng cách cắt liên kết phosphodiester – xương sống của DNA – gỡ bỏ cuộn xoắn của DNA, sau đó hình thành hợp chất trung gian cộng hóa trị phosphotyrosine với DNA [94]. Các enzyme topoisomerase được chia thành hai nhóm lớn dựa trên chức năng chính của từng loại: topoisomerase I (TopI) tháo xoắn một sợi của chuỗi xoắn kép DNA, topoisomerase II (TopII) tháo xoắn hai sợi của chuỗi xoắn kép DNA (hình 1.1). Các thuốc chống ung thư nhắm mục tiêu là enzyme topoisomerase có tác dụng gây độc enzyme topoisomearase, dẫn đến quá trình tháo xoắn bị dừng lại và cuối cùng là đứt gãy chuỗi xoắn kép DNA [95].
(Nguồn: Internet)
Hình 1.7. Mô tả enzyme topoisomerase I (TopI) và topoisomerase II (TopII) tháo
(Nguồn: Redinbo [96]) Miền đầu tận cùng NH2 (màu xanh lơ), miền lõi gồm 3 miền phụ core subdomain I-III (màu vàng, xanh dương và đỏ), miền liên kết (màu trắng), miền đầu tận cùng COOH (màu xanh lá), chuỗi xoắn kép DNA
Hình 1.8. Cấu trúc của phức hợp enzyme TopI-DNA người (TopI-DNA)
Cấu trúc của phức hợp enzyme TopI-DNA ở người bao gồm chuỗi xoắn kép DNA và enzyme TopI (hình 1.8). Enzyme TopI có trọng lượng phân tử khoảng 93 kDa, bao gồm 4 miền chính: miền đầu tận cùng NH2 24 kDa (N-terminal domain), miền lõi 56 kDa (core domain – gồm 3 miền lõi phụ core subdomain I-III), miền liên kết 7 kDa (linkder domain) và miền đầu tận cùng COOH 6 kDa (C-terminal domain) chứa amino acid xúc tác Tyr-723 [97]. Trong đó miền đầu tận cùng NH2 đóng vai trò không thể thiếu trong hoạt động xúc tác của phức hợp enzyme [97]. Trong phức hợp này, enzyme TopI bao bọc xung quanh chuỗi xoắn kép DNA do đó giữa enzyme TopI và DNA tương tác với nhau bằng nhiều liên kết, đa phần là liên kết phosphate [98, 99]. Tham gia vào quá trình hoạt động xúc tác của phức hợp là các amino acid quan trọng Lys532, Tyr723, Arg488, Arg590 và His632 nằm ở vùng hoạt động (active site) được giới hạn bởi miền đầu tận cùng NH2, COOH và chuỗi xoắn kép DNA. Lys523 gắn với nguyên tử oxy của base thymine10 trên chuỗi xoắn (ở phần bị cắt đứt bởi enzyme TopI), Tyr723 tấn công vào nguyên tử phospho của nhóm phosphate nằm trên chuỗi xoắn, trong khi đó các amino acid Arg488, Arg590 và His632 có tác dụng làm ổn định trạng thái chuyển tiếp nhóm phosphate của chuỗi [96, 99].
(Nguồn: Wall và Staker [100, 101]) Hình 1.9. (a) Cấu trúc của CPT, (b) Cấu trúc ba chiều của phức hợp bậc ba CPT-
TopI-DNA, (c) CPT xen vào chuỗi xoắn DNA và (d) các amino acid ở vùng hoạt động của CPT trong phức hợp
Camptothecin (CPT) được biết đến là hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế khối u cao, theo cơ chế ức chế phức hợp enzyme TopI-DNA [102, 103]. CPT gắn kết vào phức hợp TopI-DNA tạo thành phức hợp bậc 3 bền CPT-TopI-DNA (ternary complex) [101], TopI-DNA bị kẹt lại không thể tiếp tục thực hiện chức năng tháo xoắn chuỗi DNA [104, 105] (hình 1.9). Cấu trúc tinh thể của phức hợp bậc 3 này cho thấy CPT xen vào chuỗi xoắn của phần DNA phân tách, nằm cách 3.8 đến 4.0 Å và tương tác với các amino acid Lys532, Tyr723 và thymine10 ở vùng hoạt động của TopI-DNA. Nguyên tử oxy ở C17 tương tác và cách 4.0 Å với Asn722. Trong khi đó, nhóm hydroxyl ở C-20 tạo liên kết hydro với Asp533 – đặc trưng cho độ nhạy của enzyme với CPT [105]. Tương tác gần nhất của CPT với enzyme là với Arg364, cách
2.9 Å.
1.4.2.2. Tình hình nghiên cứu mô hình docking của các hợp chất có khung benzimidazole và indole trên đối tượng tác động phức hợp TopI-DNA
a) Khung benzimidazole
Các nghiên cứu cho thấy khung cấu trúc benzimidazole đã được nhìn nhận như là những tác nhân ức chế tế bào ung thư và đặc biệt có đích tác động là phức hợp enzyme topoisomerase I-DNA [106-108]. Cụ thể đã có các nghiên cứu về khả năng ức chế TopI-DNA trên các dẫn xuất 2-phenylbenzimidazole 2 và 9 (J. La Voie
1996 [109]), dẫn xuất I-III (Z. Topcu et al, 2007 [110]), các bis-benzimidazole
Hoechst 33458 và Hoechst 33342 (R. Kakkar et al, 2019 [111]) (hình 1.10).
Hình 1.10. Các tác nhân ức chế phức hợp Topoisomerase I-DNA có chứa khung
benzimidazole
Song song đó là các nghiên cứu sử dụng mô hình docking để giải thích và hiểu rõ hơn cơ chế gắn kết của các dẫn xuất benzimidazole vào phức hợp TopI- DNA ở mức độ phân tử. Để chứng minh hợp chất 5n có khả năng ức chế TopI-DNA tương tự như camptothecin và Hoechst 33342, Cevik (năm 2020) đã nghiên cứu tương tác của 5n với phức hợp TopI-DNA bằng mô hình docking (PDB ID: 1T8I), sử dụng phần mềm Glide 7.1 (hình 1.11).
(Nguồn: Cevik, 2020 [43]) Hình 1.11. Kết quả docking của 5n: (A) 5n nằm trong khoang hoạt động của
phức hợp TopI-DNA, (B) Các tương tác chính của 5n với khoang hoạt động của phức
Kết quả cho thấy 5n tương tác với DNA và ngăn không cho TopI gắn kết vào DNA. Cụ thể 5n có tương tác với các amino acid chính Glu356, Arg364, Lys425, Arg488, Lys532, Asp533, Thr718 trong khoang hoạt động của phức hợp TopI-DNA bằng liên kết hydro và lực van der Waals, ngoài ra còn tương tác với các base da113, dc112 và dt10 của chuỗi DNA [43].
b) Khung indole
Các nghiên cứu cho thấy khung cấu trúc indole đã được nhìn nhận như một trong những tác nhân ức chế topoisomerase I-DNA, cụ thể như hợp chất evodiamine chứa khung nền indole trong phân tử đã được chứng minh ức chế chọn lọc phức hợp TopI-DNA (A. L.-F Chan et al, 2009 [112]), hợp chất 18a (R. Chaniyara et al, 2013 [113]), dẫn xuất 4n (C. Zhang et al, 2016 [114]), dẫn xuất 6n (B. Shu et al, 2020 [115]) (hình 1.12).
Hình 1.12. Các tác nhân ức chế phức hợp Topoisomerase I-DNA có chứa khung
indole
Song song đó là các nghiên cứu trên mô hình docking như nghiên cứu của Wannian Zhang (2010) trên các dẫn xuất của evodiamine cho thấy hợp chất 29u có khả năng ức chế tốt trên 3 dòng tế bào thử nghiệm A549, MDA-MB-231 và HCT116 (IC50 lần lượt là 0,86; 0,049 và 2,6 µM), tương đương và có khả năng ức chế tốt hơn CPT (IC50 lần lượt là 0,057; 3,1 và 0,71 µM). Hợp chất 29u được tiếp tục nghiên cứu bằng mô hình docking để hiểu rõ khả năng gắn kết ở mức độ phân tử với phức hợp
TopI-DNA (PDB ID: 1T8I), kết quả cho thấy 29u nằm trong khoang hoạt động của TopI-DNA và có cách thức gắn kết giống với CPT khi hình thành tương tác với chuỗi DNA, ngoài ra nó còn hình thành tương tác với phức hợp bằng liên kết hydro với amino acid Arg364 [116] (hình 1.13).
(Nguồn: Wannian Zhang, 2010 [116]) Hình 1.13. (A) Cấu trúc của dẫn xuất evodiamine 29u (B) Cấu hình docking của
29u và CPT được chồng lên (C) 29u gắn kết vào khoang hoạt động của TopI-DNA
Dựa vào các phân tích trên, nhóm nghiên cứu đã đề xuất một trong những cơ chế ức chế ở mức độ phân tử đối với tế bào ung thư của các dẫn xuất benzimidazole và indole có hoạt tính tốt nhất: đích tác động phức hợp topI-DNA (PDB: 1T8I) và so sánh với đối chứng dương camptothecin để làm rõ cách thức gắn kết của các dẫn xuất này vào phức hợp TopI-DNA.
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị,
2.1.1. Các hóa chất tổng hợp
Các hóa chất được mua từ các hãng: Fisher, Acros, Merck, Aldrich-Sigma, Xilong, Chemsol và sử dụng trực tiếp không qua tinh chế lại (bảng 2.1).
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong quá trình tổng hợp
Hóa chất Xuất xứ Độ tinh khiết (%)
o-Phenylen diamine Acros 98
3,4-Diaminotoluene Acros 97
3,4-Diaminobenzophenone Merck 99
4-Chloro-benzene-1,2-diamine Acros 97
4,5-Dichloro-o-phenylenediamine Acros 98
Salycilic aldehyde Acros 99
3-Hydroxybenzaldehyde Acros 98,5
4-Hydroxybenzaldehyde Acros 99
4-Methoxybenzaldehyde Merck 99
2,5-Dimethoxy benzaldehyde Acros 97
3,4,5- Trimethoxy benzaldehyde Acros 99
4-Dimetylaminobenzaldehyde Fisher 99 2-(Trifluoromethyl)-benzaldehyde Sigma-Aldrich 98 4-Benzyloxybenzaldehyde Acros 98 2-Nitrobenzaldehyde Acros 99 5-Iodovanillin Acros 97 4-Chlorobenzaldehyde Acros 98,5
Sodium metabisulfite Merck > 98
Sodium tetrahydroborate Fisher 98
Formaldehyde Fisher 37
Pyrrolidine Acros 99
Morpholine Fisher 99
1-Methylpiperazine Acros 99
Indole Acros 99
5-Bromoindole Acros 99
Indole-2-carboxylic acid Acros 99
2-Phenylindole Acros 99
Ethylene glycol Xilong > 99
Ethyl acetate Xilong 99,5
Ethanol Xilong 95 Chloroform Chemsol > 99 n-Hexane Xilong > 97 Methanol Xilong > 99,5 Acetone Xilong > 99,5 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị
Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong quá trình tổng hợp hóa học được liệt kê trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các dụng cụ và thiết bị sử dụng trong tổng hợp
Dụng cụ Thiết bị
Bình cầu một cổ cổ nhám Cân kỹ thuật
Bình cầu hai cổ cổ nhám Máy khuấy từ gia nhiệt IKA Ống nhỏ giọt Bộ lọc hút chân không Buchner
Becher, erlen Đèn soi UV 254 nm
Đũa thủy tinh Máy cô quay Buchi Rotavapor R 200
Pipet Tủ sấy chân không OV – 01
Ống sinh hàn Bơm chân không
Nhiệt kế
Cột chạy sắc ký Phễu lọc
2.2. Tổng hợp các dẫn xuất benzimidazole và indole
2.2.1. Tổng hợp các dẫn xuất của benzimidazole
Sơ đồ 2.1. Tổng hợp các dẫn xuất của benzimidazole Bảng 2.3. Cấu trúc của các dẫn xuất benzimidazole tổng hợp
Số thứ tự Tên dẫn xuất* X Y Z R1 R2 R3 R4 1 12H H H - OH H H H 2 13H H H - H OH H H 3 14H H H - H H OH H 4 1MM H H - H H OCH3 H 5 1DM H H - OCH3 H H OCH3
6 1TM H H - H OCH3 OCH3 OCH3
7 1DA H H - H H N(CH3)2 H 8 12N H H - NO2 H H H 9 1TF H H - CF3 H H H 10 1IV H H - H OCH3 OH I 11 1BO H H - H H O-CH2-Ph H 12 1BA H H - H H H H 13 22H H CH3 - OH H H H 14 23H H CH3 - H OH H H
15 24H H CH3 - H H OH H
16 2MM H CH3 - H H OCH3 H
17 2DM H CH3 - OCH3 H H OCH3
18 2TM H CH3 - H OCH3 OCH3 OCH3
19 2DA H CH3 - H H N(CH3)2 H 20 22N H CH3 - NO2 H H H 21 2TF H CH3 - CF3 H H H 22 2IV H CH3 - H OCH3 OH I 23 2BO H CH3 - H H O-CH2-Ph H 24 32H H Cl - OH H H H 25 33H H Cl - H OH H H 26 34H H Cl - H H OH H 27 3MM H Cl - H H OCH3 H 28 3DM H Cl - OCH3 H H OCH3
29 3TM H Cl - H OCH3 OCH3 OCH3
30 3DA H Cl - H H N(CH3)2 H 31 32N H Cl - NO2 H H H 32 3TF H Cl - CF3 H H H 33 3IV H Cl - H OCH3 OH I 34 3BO H Cl - H H O-CH2-Ph H 35 42H Cl Cl - OH H H H 36 43H Cl Cl - H OH H H 37 44H Cl Cl - H H OH H 38 4MM Cl Cl - H H OCH3 H 39 4DM Cl Cl - OCH3 H H OCH3
40 4TM Cl Cl - H OCH3 OCH3 OCH3
41 4DA Cl Cl - H H N(CH3)2 H 42 42N Cl Cl - NO2 H H H 43 4TF Cl Cl - CF3 H H H 44 4IV Cl Cl - H OCH3 OH I 45 4BO Cl Cl - H H O-CH2-Ph H 46 52H H Ph-CO - OH H H H 47 53H H Ph-CO - H OH H H 48 54H H Ph-CO - H H OH H 49 5MM H Ph-CO - H H OCH3 H
50 5TM H Ph-CO - H OCH3 OCH3 OCH3
51 5DA H Ph-CO - H H N(CH3)2 H
52 52N H Ph-CO - NO2 H H H
53 5TF H Ph-CO - CF3 H H H
55 5BO H Ph-CO - H H O-CH2-Ph H
56 62H H - Ph- CH(OH) OH H H H
57 63H H - Ph- CH(OH) H OH H H
58 64H H - Ph- CH(OH) H H OH H
59 6MM H - Ph- CH(OH) H H OCH3 H
60 6TM H - Ph- CH(OH) H OCH3 OCH3 OCH3
61 6DA H - Ph- CH(OH) H H N(CH3)2 H
62 6TF H - Ph- CH(OH) CF3 H H H
63 6IV H - Ph- CH(OH) H OCH3 OH I
64 6BO H - Ph- CH(OH) H H O-CH2-Ph H
(*) Ký hiệu tên các dẫn xuất benzimidazole gồm hai phần số và chữ cái biểu thị cho hợp phần o- phenylenediamine và benzaldehyde tương ứng: phần số – biểu thị cho cấu trúc của o-phenylenediamine với độ phức tạp của nhóm thế tăng dần ở X và Y (1: X = Y = H; 2: X = H, Y = CH3; 3: X = H, Y = Cl; 4: X = Y = Cl; 5: X = H, Y = Ph-CO–; 6: X = H, Y = Ph- CH(OH)–); và phần chữ cái – biểu thị cho hợp phần benzaldehyde (2H, 3H và 4H: lần lượt chứa nhóm thế Hydroxyl ở vị trí 2, 3 và 4; MM, DM, TM: lần lượt chứa một, hai và ba nhóm thế Methoxy; DA: chứa nhóm DimethylAmin; 2N: chứa nhóm Nitro ở vị trí số 2; TF: chứa nhóm TriFlouro; IV: chứa Iodine và Vanillin; BO: chứa nhóm BenzylOxy; BA: BenzAldehyde)
Tổng hợp các dẫn xuất benzimidazole theo quy trình đã có [52], các dẫn xuất có số thứ tự từ 1 đến 55 (sơ đồ 2.1, bảng 2.3 và hình 2.1): lấy 2 mmol của các dẫn xuất o-phenylenediamine và 2 mmol của các dẫn xuất benzaldehyde cho vào bình
cầu 2 cổ có chứa sẵn 15 mL hỗn hợp dung môi ethanol:nước (tỉ lệ 9:1 v/v). Sau đó cho thêm 2 mmol Na2S2O5 vào bình phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được khuấy đều trong 2h. Sau phản ứng, hỗn hợp được mang đi lọc chân không và cô quay phần nước lọc được dưới áp suất thấp, thu được sản phẩm thô. Phần sản phẩm thô này được lần lượt đem rửa với nước và hexan (3 lần), sau đó sấy chân không ở 80 °C đến khối lượng không đổi. Quá trình kết tinh hoặc làm sạch bằng sắc kí cột được sử dụng và được nêu cụ thể ở phần xác định cấu trúc cho từng chất.
Hình 2.1. Quá trình tổng hợp các dẫn xuất benzimidazole, giai đoạn (1)
Tổng hợp các dẫn xuất benzimidazole có số thứ tự từ 56 đến 64 (sơ đồ 2.1, bảng 2.3 và hình 2.2.): lấy 1 mmol các dẫn xuất benzimidazole có số thứ tự từ 46 đến 51 và số thứ tự từ 53 đến 55 cho vào bình cầu 2 cổ, 5 mL methanol được thêm vào bình phản ứng. Hỗn hợp được khuấy đều cho đến khi thu được dung dịch đồng nhất, sau đó 2 mmol NaBH4 được thêm vào hỗn hợp phản ứng. Phản ứng được theo dõi bằng sắc kí bản mỏng, sử dụng hệ giải ly hexane:ethyl acetate (tỉ lệ 95:5 hoặc 9:1). Hỗn hợp sau phản ứng được cô quay dưới áp suất thấp để loại bỏ dung môi, thu được sản phẩm thô. Phần sản phẩm thô này được đem rửa nhiều lần với nước, sau đó sấy chân không đến khối lượng không đổi. Quá trình kết tinh hoặc làm sạch bằng sắc kí cột được sử dụng và được nêu cụ thể ở phần xác định cấu trúc cho từng chất.
Hình 2.2. Quá trình tổng hợp các dẫn xuất benzimidazole, giai đoạn (2)
Cơ chế phản ứng ngưng tụ này được đề xuất như sau [117] (sơ đồ 2.2):
TS1 và TS2 là hai trạng thái chuyển đổi lưỡng cực được hình thành trong quá trình phản ứng. Sơ đồ 2.2. Cơ chế phản ứng đóng vòng benzimidazole
Giai đoạn 1: Đầu tiên Na2S2O5 phản ứng với nước tạo thành NaHSO3. Sau đó, aldehyde phản ứng cộng với NaHSO3 tạo thành bisulfite aldehyde. Đôi điện tử tự do của 1 nhóm NH2 trên dẫn xuất o-phenylenediamine tấn công vào nguyên tử
của bisulfite aldehyde và loại bỏ 1 phân tử H2O hình thành dạng alkyl sulfonate. Alkyl sulfonate sẽ tiếp tục phản ứng với nhóm amine còn lại của phenylamine, dẫn đến sự hình thành hợp chất trung gian dihydroimidazole và tách muối NaHSO3. Giai đoạn 2: Quá trình vòng hóa và tách H2 tạo thành sản phẩm. Do cấu tạo không bền nên dihydroimidazole dễ tách hydro để tạo thành cấu trúc bền hơn. Trong giai đoạn này, việc đóng vòng benzimidazole được hoàn tất.
2.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất indole dựa trên phản ứng Mannich đa hợp phần
Phản ứng tổng hợp các dẫn xuất indole được mô tả ở sơ đồ bên dưới:
Sơ đồ 2.3. Tổng hợp các dẫn xuất của indole Bảng 2.4. Cấu trúc của các dẫn xuất indole tổng hợp
Hợp
chất* R R1
Amine
bậc hai R2 Dung môi
CPF H COOH H MeOH
CMF H COOH H MeOH
CIF H COOH H MeOH PPF H C6H5 H EG PMF H C6H5 H EG PAF H C6H5 H EG CPM H COOH 4-MeO-C6H4 EG CMM H COOH 4-MeO-C6H4 EG
CIM H COOH 4-MeO-C6H4 EG
PPM H C6H5 4-MeO-C6H4 EG
IPM H H 4-MeO-C6H4 EG