Các tế bào ung thư được nuôi cấy in vitro theo phương pháp của Tim Mosmann và cộng sự [122]. Tế bào được nuôi cấy 48h trong môi trường RPMI 1640 hoặc DMEM ở 37 oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin (100 unit/mL) và streptomycin (100µg/mL). Sau đó chúng được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng với thể tích là 200 µl, mật độ 2-5x105 tế bào/giếng (tuỳ từng loại tế bào). Sau 24h, chúng được thử với hợp chất pha sẵn ở các nồng độ khác nhau trong DMSO. Sau 72h, cho phản ứng với 0,5 mg/µL MTT, ủ 4h ở 37oC và 5% CO2. Sau đó hút bỏ hết môi trường trên bề mặt, kết tủa formazan được hòa tan trong isopropanol. Camptothecin (CPT) được sử dụng làm chứng dương. 2.3.3. Đánh giá kết quả OD (mẫu thử) – OD ( ngày 0) % = [ �� OD (DMSO) – OD ( ngày 0) × 100] ± ��
Trong đó: CS% (Cell Survival%): tỉ lệ sống sót của tế bào; OD: mật độ quang; SD (Standard Deviation): độ lệch tiêu chuẩn, được tính bằng công thức bên dưới.
√(∑ �� − ��)2 =
�� � − 1
Trong đó: xi: giá trị OD tại giếng i; ��: giá trị OD trung bình; n: số giếng thử lặp lại Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS ≤ 50% ± SD) sẽ được chọn ra cho bước thử nghiệm tiếp theo.
2.4. Xây dựng mô hình docking phân tử
Các phần mềm và thiết bị sử dụng trong quá trình docking được liệt kê chi tiết ở bảng 2.5.
Bảng 2.5. Các phần mềm và thiết bị sử dụng trong quá trình docking
Phần mềm Mục đích sử dụng Thương
mại
ChemDraw 19.1 [123] Xây dựng cấu trúc 2D X
MOE 2015.10 [124] Chuyển đổi cấu trúc 2D sang 3D, và tối ưu hóa cấu trúc 3D của các hợp chất (tối thiểu hóa năng lượng).
Bước 1 Bước 2 Bước 3 Bước 4
Đánh giá kết quả từ mô hình Docking các ligand với mục tiêu tác động
Docking lặp lại (Re-docking) Chuẩn bị cơ sở dữ liệu
Chuẩn bị và tối ưu hóa cấu trúc protein cho quá trình docking.
Sybyl-X 1.1 [125] Mô phỏng động lực học phân tử của các hợp chất để chọn ra được cấu trúc có năng lượng tối thiểu toàn phần
X
BiosolveIT LeadIT 2.1.8 [126]
Docking phân tử X
Discovery Studio Visualizer 4.0 [127]
Phân tích tương tác và trình bày cấu trúc sau khi docking
Thiết bị
Tất cả các quá trình xây dựng mô hình docking được thực hiện trên hệ thống máy vi tính có cấu hình Intel(R) Core(TM) i3-9100F CPU @ 3,60GHz, 8GB RAM, Visual Graphic Card: NVIDIA GeForce GTX 1650 4GB và trên hệ điều hành 64 bit Windows
10 (Microsoft, Redmond, WA, USA)
Quy trình xây dựng mô hình docking gồm các bước sau:
2.4.1. Chuẩn bị cơ sở dữ liệu
Các cấu tử được vẽ công thức cấu tạo bởi chương trình ChemDraw Ultra 19.1. Tiếp tục được tối ưu hoá năng lượng bằng chương trình MOE 2015.10. Tối ưu hóa năng lượng lần 2 được thực hiện bởi chương trình Sybyl-X 1.1 nhằm đưa ra được cấu dạng có năng lượng tối thiểu trong toàn bộ các cấu dạng được tạo ra. Vì các cấu dạng ban đầu được vẽ bằng phần mềm ChemDraw nên độ dài các liên kết, vị trí các nguyên
tử, góc liên kết có thể không phù hợp với thực tế. Do đó việc tối ưu hóa năng lượng sẽ quay lại các góc liên kết, đặt lại vị trí các nguyên tử, điều chỉnh độ dài các liên kết nhằm tạo ra cấu dạng có năng lượng tối thiểu. Cấu dạng có năng lượng tối thiểu thường bền hơn các cấu dạng có năng lượng cao hơn. Việc chọn lựa cấu dạng có năng lượng tối thiểu nhằm nâng cao khả năng tương thích giữa kết quả docking và khả năng thể hiện hoạt tính thực tế của cấu tử.
2.5.1.1. Chuẩn bị cấu trúc protein
Cấu trúc protein được chuẩn bị trong MOE 2015.10 bằng công cụ Sequence Editor và QuickPrep. Phức hợp protein được sử dụng trong nghiên cứu docking đối với các dẫn xuất benzimidazole là phức hợp enzyme topoisomerase I (TopI) DNA của người với CPT và cộng hóa trị với một chuỗi DNA xoắn kép, được tải về từ ngân hàng protein (RCSB Protein Data Bank), ký hiệu là 1T8I. Nước kết tinh (HOH) và ion (Na+, Cl-…) trong dung môi cũng sẽ được xoá bỏ. Hình 2.4 cho thấy ligand đồng kết tinh tương tác tốt với cấu trúc khoang gắn kết được tạo ra để tiến hành docking.
Hình 2.4. Cấu trúc khoang gắn kết của phức hợp TopI và chuỗi DNA xoắn kép với
ligand CPT
2.5.1.2. Chuẩn bị cấu trúc ligand
Cấu trúc 2D của các ligand được chuẩn bị bằng phần mềm Chemdraw 19.1 và lưu file có định dạng *.mol2 để tiến hành bước xử lý tối ưu thiểu hóa năng lượng trong Sybyl-X 2.0. Các bước chuẩn bị trong Sybyl-X 2.0 bao gồm tối thiểu hóa năng lượng lần 1, chạy động lực học, sau đó tối thiểu hóa năng lượng lần 2. Các thông số tối thiểu hóa năng lượng cho cả lần 1 và 2 được thiết lập như sau:
- Method (phương pháp): Conj Grad (Gradient liên hợp)
- Termination → Enery Change: 0,0001 kcal/mol
- Mã Iterations (số bước lặp lại): 10.000
- Modify → Charge (Trường lực): Gasteiger-Huckel
- Các thông số khác được để mặc định.
Động lực học phân tử được tiến hành bằng công cụ Compute → Dynamics →
Setup Simulated Annealing. Thông số Run = 5 và các thông số khác mặc định. Quá
trình động học mô phỏng này có tác dụng giúp phân tử vượt qua trạng thái năng lượng tối thiểu cục bộ. Sau đó, nhờ lần tối thiểu hóa năng lượng thứ 2 để tìm ra trạng thái năng lượng tối thiểu toàn phần của phân tử đó.
Sau khi thực hiện bước chuẩn bị này, các ligand sẽ được lưu thành một tập dữ liệu chung định dạng *.sdf để phần mềm LeadIT 2.1.8 [126] có thể đọc được và thực hiện docking.
2.4.2. Docking lặp lại (re-docking)
Để đánh giá các thông số docking, cách xử lý protein và ligand có phù hợp hay không, quá trình docking lặp lại (re-docking) được tiến hành, phân tử hợp chất (ligand) có sẵn trong cấu trúc tinh thể phức hợp được trích xuất ra docking lặp lại vào khoang gắn kết. Các bước tiến hành re-docking như sau:
- Ligand đồng kết tinh được xuất ra và lưu lại dưới dạng *.mol2 (ví dụ: tên Ligand_export.mol2.)
- Vẽ ligand đồng kết tinh và xử lý bằng Sybyl-X 1.1 (như bước 2.5.1.2), lưu lại dưới dạng *.mol2, đặt tên Ligand_ve.mol2.
- Ligand đồng kết tinh được xử lý tương tự với ligand vẽ, lưu lại dưới dạng *.mol2, đặt tên Ligand_xu-ly.mol2.
- Tập hợp ba ligand lại thành một tập dữ liệu, lưu lại dưới dạng *.sdf.
- Tiến hành re-doking với phần mềm LeadIT với các bước tiến hành được miêu tả như bước 1.4.3., sau đó xác định giá trị RMSD (căn bậc hai của bình phương độ lệch trung bình của cấu dạng ligand sau docking so với cấu dạng có sẵn trong cấu trúc tinh thể). Kết quả re-docking đáng tin cậy khi RMSD ≤ 2 Å, đồng thời so sánh các tương tác trong cấu trúc tinh thể với các tương tác tạo ra sau docking có giống nhau hay không.
2.4.3. Docking các ligand với mục tiêu tác động và đánh giá kết quả
Khi khoang gắn kết đã được xây dựng, tiến hành docking bằng Docking →
Define FlexX Docking → Docking Library → Load File. Các thông số sử
dụng khi docking là:
- Number of Poses to Keep (số cấu dạng có chỉ số docking âm nhất được giữ
lại): Top10 (10)
- Docking Library: thư viện ligand được sử dụng.
- Maximum Number of Solutions per Iteration (số lần lặp lại tối đa): 1.000.
- Maximum Number of Solutions per Fragmentation (số lần phân mảnh tối đa):
200.
Chọn Apply & Dock! để bắt đầu docking.
Kết quả sau khi docking được lưu dưới dạng tệp *.sdf bằng đường dẫn Docking → Export Poses. Toàn bộ quá trình docking cũng được lưu lại bằng đường dẫn
LeadIT → Save Project As, định dạng *.fxx.
Kết quả tương tác giữa cấu dạng docking của các ligand với vị trí gắn kết của CPT trong phức hợp TopI-DNA được hiển thị và phân tích bằng phần mềm Discovery Studio Visualizer 4.0 và MOE 2015.10. Các tương tác này bao gồm: liên kết hydro, tương tác π-π, tương tác van der Waals, các tương tác cation-π, các tương tác ion.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Tổng hợp các dẫn xuất benzimidazole và indole
3.1.1. Tổng hợp các dẫn xuất benzimidazole
Bảng 3.1. Cấu trúc và hiệu suất tổng hợp của các dẫn xuất benzimidazole tổng hợp
Số thứ tự Tên dẫn xuất X Y Z R1 R2 R3 R4 Hiệu suất* (%) 1 12H H H - OH H H H 73 2 13H H H - H OH H H 81 3 14H H H - H H OH H 91 4 1MM H H - H H OCH3 H 81 5 1DM H H - OCH3 H H OCH3 74
6 1TM H H - H OCH3 OCH3 OCH3 73
7 1DA H H - H H N(CH3)2 H 97 8 12N H H - NO2 H H H 73 9 1TF H H - CF3 H H H 82 10 1IV H H - H OCH3 OH I 97 11 1BO H H - H H O-CH2-Ph H 77 12 1BA H H - H H H H 97 13 22H H CH3 - OH H H H 96 14 23H H CH3 - H OH H H 98 15 24H H CH3 - H H OH H 89 16 2MM H CH3 - H H OCH3 H 89 17 2DM H CH3 - OCH3 H H OCH3 83
18 2TM H CH3 - H OCH3 OCH3 OCH3 93
19 2DA H CH3 - H H N(CH3)2 H 97 20 22N H CH3 - NO2 H H H 88 21 2TF H CH3 - CF3 H H H 90 22 2IV H CH3 - H OCH3 OH I 98 23 2BO H CH3 - H H O-CH2-Ph H 95 24 32H H Cl - OH H H H 68 25 33H H Cl - H OH H H 54 26 34H H Cl - H H OH H 41 27 3MM H Cl - H H OCH3 H 63 28 3DM H Cl - OCH3 H H OCH3 84
29 3TM H Cl - H OCH3 OCH3 OCH3 81 30 3DA H Cl - H H N(CH3)2 H 81 31 32N H Cl - NO2 H H H 67 32 3TF H Cl - CF3 H H H 83 33 3IV H Cl - H OCH3 OH I 98 34 3BO H Cl - H H O-CH2-Ph H 48 35 42H Cl Cl - OH H H H 85 36 43H Cl Cl - H OH H H 78 37 44H Cl Cl - H H OH H 78 38 4MM Cl Cl - H H OCH3 H 87 39 4DM Cl Cl - OCH3 H H OCH3 82
40 4TM Cl Cl - H OCH3 OCH3 OCH3 90
41 4DA Cl Cl - H H N(CH3)2 H 73 42 42N Cl Cl - NO2 H H H 32 43 4TF Cl Cl - CF3 H H H 52 44 4IV Cl Cl - H OCH3 OH I 85 45 4BO Cl Cl - H H O-CH2-Ph H 68 46 52H H Ph-CO - OH H H H 75 47 53H H Ph-CO - H OH H H 78 48 54H H Ph-CO - H H OH H 84 49 5MM H Ph-CO - H H OCH3 H 84
50 5TM H Ph-CO - H OCH3 OCH3 OCH3 83
51 5DA H Ph-CO - H H N(CH3)2 H 98
52 52N H Ph-CO - NO2 H H H 54
53 5TF H Ph-CO - CF3 H H H 53
54 5IV H Ph-CO - H OCH3 OH I 98
55 5BO H Ph-CO - H H O-CH2-Ph H 76
56 62H H - Ph- CH(OH) OH H H H 42
57 63H H - Ph- CH(OH) H OH H H 56
58 64H H - Ph- CH(OH) H H OH H 38
59 6MM H - Ph- CH(OH) H H OCH3 H 71
60 6TM H - Ph- CH(OH) H OCH3 OCH3 OCH3 76
61 6DA H - Ph- CH(OH) H H N(CH3)2 H 63
62 6TF H - Ph- CH(OH) CF3 H H H 28
63 6IV H - Ph- CH(OH) H OCH3 OH I 96
64 6BO H - Ph- CH(OH) H H O-CH2-Ph H 43
(*) Hiệu suất toàn phần
Kết quả tổng hợp 64 dẫn xuất benzimidazole được trình bày ở bảng 3.1. Ở giai đoạn đầu tiên các dẫn xuất o-phenylenediamine được cho ngưng tụ với một loạt các
benzaldehyde chứa các nhóm thế khác nhau (OH, OCH3, NO2, N(CH3)2, CF3, I, O- CH2-Ph) ở điều kiện êm dịu, sử dụng hỗn hợp dung môi ethanol và nước (tỉ lệ 9:1) và chất oxy hóa Na2S2O5, với hiệu suất từ 32% đến 98%. Na2S2O5 là một muối vô cơ, khó hòa tan trong dung môi hữu cơ như ethanol, phải sử dụng nhiệt độ cao để tiến hành phản ứng, dẫn đến khó kiểm soát phản ứng hoặc tạo ra các sản phẩm phụ không mong muốn [41, 128]. Do đó nước được cho vào nhằm mục đích tăng khả năng hòa tan của Na2S2O5 vào trong dung dịch phản ứng, giúp phản ứng xảy ra dễ dàng ở điều kiện êm dịu, hạn chế sản phẩm phụ sinh ra, quá trình xử lý sau phản ứng trở nên đơn giản hơn.
Tiếp theo đó là các dẫn xuất 52H, 53H, 54H…5BO được đem đi khử bằng tác nhân NaBH4 trong methanol, thu được các dẫn xuất 62H, 63H, 64H…6BO, với hiệu suất từ 28% đến 96%. Ưu điểm của phương pháp khử này là dùng tác nhân khử êm dịu NaBH4 và methanol là dung môi được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm. Khó khăn ở phương pháp này là NaBH4 phân hủy nhanh, dễ hút ẩm trong quá trình tiến hành phản ứng, do đó tỉ lệ mol giữa tác nhân phản ứng và NaBH4 được điều chỉnh lại 1:2 thay vì 1:1 để đảm bảo thu được sản phẩm ở hiệu suất tối đa.
3.1.2. Tổng hợp các dẫn xuất indole
Bảng 3.2. Cấu trúc và hiệu suất của các dẫn xuất indole tổng hợp
Hợp
chất R R1
Amine
bậc hai R2 Dung môi
Hiệu suất (%)
CPF H COOH H MeOH 98
CMF H COOH H MeOH 53
CIF H COOH H MeOH 60 PPF H C6H5 H EG 63 PMF H C6H5 H EG 59 PAF H C6H5 H EG 94 CPM H COOH 4-MeO-C6H4 EG 89 CMM H COOH 4-MeO-C6H4 EG 86
CIM H COOH 4-MeO-C6H4 EG 62
PPM H C6H5 4-MeO-C6H4 EG 61
IPM H H 4-MeO-C6H4 EG 88
BPM Br H 4-MeO-C6H4 EG 78
BPC Br H 4-Cl-C6H4 EG 79
Sử dụng phản ứng Mannich, 14 dẫn xuất 3-aminoalkylated indole đã được tổng hợp từ các indole, aldehyde và các amine vòng no gồm pyrrolidine, morpholine, 1- methylpiperazine và piperidine trong điều kiện êm dịu, sử dụng methanol và ethylene glycol là dung môi (bảng 3.2). Ở phản ứng tổng hợp các dẫn xuất CPF, CMF, CAF và CIF, methanol dễ dàng hòa tan các tác chất, phản ứng cho hiệu suất khá cao từ 53% đến 98%. Tuy nhiên ở các dẫn xuất tiếp theo, việc hòa tan tác chất indole và đặc biệt là các benzaldehyde như 4-methoxybenzaldehyde và 4- chlorobenzaldehyde gặp khó khăn, hỗn hợp phản ứng có dạng sệt, không tạo thành một hệ đồng thể khiến cho
phản ứng diễn ra khó khăn. Sử dụng nước và các chất hỗ trợ phân tán như sodium dodecyl sulfate hoặc hệ dung môi methanol:nước để tiến hành phản ứng đều thất bại [75]. Ethylene glycol (EG) đã được lựa chọn dựa vào khả năng xúc tác phản ứng Mannich đa hợp phần, cũng như khả năng hòa tan tốt các tác chất phản ứng ban đầu [118]. Bằng cách sử dụng EG các dẫn xuất còn lại (PPF, PMF, PAF, CPM, CMM, CIM, PPM, IPM, BPM và BPC) đã được tổng hợp thành công với hiệu suất từ 59% đến 94%.
Về khả năng phản ứng, sử dụng 4 indole với tính acid khác nhau 2- phenylindole (pKa = 16,80), indole (pKa = 16,20), 5-bromoindole (pKa = 16,04), indole-2-carboxylic acid (pKa = 4,44) được cho phản ứng với lần lượt các ion iminium được tạo từ 4-methoxy benzaldehyde và các amine vòng no (pyrrolidine, morpholine, 1-methylpiperazine và piperdine) trong môi trường EG. Chỉ có indole- 2-carboxylic acid tạo được nhiều sản phẩm hơn các indole khác (3 sản phẩm CPM, CMM và CIM so các indole khác chỉ có 1 sản phẩm PPM, IPM và BPM). Các sản phẩm khác (2- phenylindole, indole và 5-bromoindole với amine piperidine, 1- methylpiperazine và morpholine) không được tạo thành dù điều kiện tiến hành phản ứng là như nhau. Kết quả này cho thấy indole càng có tính acid, phản ứng Mannich đa hợp phần càng dễ xảy ra. Điều này có thể lý giải trong môi trường acid do indole-2-carboxylic acid tạo ra đã giúp quá trình proton hóa tách nước tạo thành ion iminium diễn ra thuận lợi và nhanh hơn so với môi trường không có tính acid, làm quá trình tạo thành sản phẩm diễn ra dễ dàng hơn.
3.2. Xác định cấu trúc của các dẫn xuất benzimidazole và indole
3.2.1. Xác định cấu trúc của 64 dẫn xuất benzimidazole
3.2.1.1. 2-(1H-benzimidazol-2-yl)-phenol (ký hiệu 12H)
Sản phẩm dạng bột màu trắng, tnc (°C) = 230 – 231 °C.
Phổ FTIR (cm-1) (Phụ lục 1 – PL.1): 3457 (O-H), 3324 (N–H), 1631 (C=N), 1261 (C–N).
Phổ HR-ESI-MS (PL.2) cho mũi ion phân tử giả với m/z: [M+H]+ = 211,08771 (C13H10N2O, tương ứng lý thuyết [M+H]+ = 211,08714).
Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, ppm, J = Hz) (PL.3, 4): 7,00-7,05 (2H,